[发明专利]一株产鼠李糖脂生物表面活性剂菌株及其生产的菌剂

说明书

一、技术领域

本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂，属于生物高技术领域。是利用微生物学方法，促进土壤中多环芳烃的降解，可以应用于多环芳烃污染土壤的生物修复。

二、背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的难降解有机污染物。近年来，随着石油、煤、天然气等资源开发利用的不断加快，环境中的多环芳烃有不断增加的趋势。由于多环芳烃的潜在毒性、致癌性及致畸诱变作用，对人类健康和生态环境具有明显的生态风险。芘是具有四个苯环的稠环芳烃，是检测多环芳烃污染的指示物。生物修复技术被认为是最具潜力去除土壤或沉积物中有机污染物经济有效的方法。但由于PAHs的水溶性差，憎水性强，易吸附于沉积物或土壤的固体颗粒上，生物有效性差，从而延缓了其生物降解的速率。添加表面活性剂可增强PAHs从固体颗粒释放的速率，增大其在水中的溶解度，并通过减小固液相之间的界面张力来促进沉积物所吸附PAHs的流动，从而提高污染物的传质速率和生物有效性。目前，生物表面活性剂中最重要，数量最大，品种最多的是糖脂类生物表面活性剂。而在糖脂中最常见，研究最深入，应用最广泛的就是鼠李糖脂。鼠李糖脂在促进多环芳烃污染物的修复处理中有着显著效果。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是研究的最多的鼠李糖脂产生菌。利用以铜绿假单胞菌为生产菌株虽然可以获得较高的产量，但铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌，是一种人体条件致病菌，会带来一系列的安全问题，不能大规模工业化应用，这就迫使人们要寻找其它非致病菌作为生产鼠李糖脂的主体。这方面的研究主要集中在利用基因工程的方法，以实现鼠李糖脂的外源生产。目前为止，还是通过质粒为载体构建基因工程菌，这中方法存在质粒不稳定和引入抗生素标记的缺陷。迫切需要开发新的方法。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于针对环境修复中的实际问题和需求，开发研制出一种新型鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂。它是将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)BSFD5中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关的基因簇rhlABRI，通过无标记同源重组的方法，整合到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的模式菌株KT2440的染色体中而获得。Pseudomonas putida KT2440是一株在全世界范围内得到详尽研究和应用的菌株，是第一个被美国卫生部重组DNA委员会(Recombinant DNA Advisory Committee，RAC)认定为环境安全细菌，并许可KT2440作为基因工程的宿主菌。本发明构建的菌株KT2440-rhlABRI和现有的已质粒为基础的工程菌相比，该菌株稳定性好，生产过程中不需要添加抗生素，安全性高。菌株及其生产的菌剂可以促进土壤中多环芳烃芘的降解。

技术方案

本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株KT2440-rhlABRI，它是将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)BSFD5中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关的基因簇rhlABRI，通过无标记同源重组的方法，整合到恶臭假单胞菌的模式菌株KT2440的染色体中而获得。使用菌株KT2440-rhlABRI生产菌剂的工艺为：斜面种一摇瓶种一种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂)。详细步骤为：

1)将菌株KT2440-rhlABRI接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期。LB培养基配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，加水补足体积，pH值7.0-7.2。

2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期。种子罐所用的培养基配方为：NaNO₃ 2.5g/L，K₂HPO₄ 4.0g/L，KH₂PO₄ 4.0g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 1.0g/L，KCl 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，甘油30g/L，加水补足体积，pH值7.0-7.2。

3)将种子液按生产罐培养基的10％接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。