[发明专利]一种能用同源重组来克隆的枯草芽孢杆菌整合载体的构建及其应用无效

专利信息
申请号: 201010271750.4 申请日: 2010-09-03
公开(公告)号: CN101948866A 公开(公告)日: 2011-01-19
发明(设计)人: 李晓明;韦航;廖东庆;蒙健宗;张云光;林珊宇;李丛;陈发忠;梁莲华 申请(专利权)人: 南宁邦尔克生物技术有限责任公司
主分类号: C12N15/75 分类号: C12N15/75;C12N15/66;C12N15/63
代理公司: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 王素娥
地址: 530003 广西壮*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 一种 能用 同源 重组 克隆 枯草 芽孢 杆菌 整合 载体 构建 及其 应用
【说明书】:

技术领域

发明属于生物技术领域,具体是一种能用同源重组来克隆的在枯草芽孢杆菌中整合表达外源DNA片段的载体的构建及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是非致病的,不产毒素和致热致敏蛋白质,是一种食品安全的菌种,被归为食品级微生物范畴。而且枯草芽孢杆菌作为表达系统,具有以下优点:1具有很强的蛋白质分泌功能,不需要破碎细胞来提取蛋白质,只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质,目前已有多种外源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达。2没有明显的密码子偏爱性,同时表达产物也不容易形成包函体。3发酵条件简单。因此,开发利用枯草芽孢杆菌作为表达系统具有深远的意义。根据所采用载体的类型不同,枯草芽孢杆菌表达模式可分为染色体整合表达和可复制载体表达两种。在染色体整合表达中外源基因在宿主中可保持较好的稳定性,而复制载体通常不稳定,一般需加抗生素来维持。但是抗生素在食品及食品添加剂生产中是不能添加的。因此,枯草芽孢杆菌染色体基因组整合型表达是食品药品生产发展的一个趋势。pMLK83是一个常用的整合载体。它通过双交换把外源基因置换枯草芽孢杆菌中的α-淀粉酶基因,利于整合的筛选。所整合的基因能稳定的存在于枯草芽孢杆菌的基因组中。然而,pMLK83的多克隆位点只有5个单一的,能用于克隆的限制性内切酶位点(Sal I,HindIII,BamH I,SpeI和SacII),而且pMLK83是比较大的载体,长度达8.8kb,这些给将外源基因克隆到pMLK83带来一定的不便。

重组克隆方法虽然简单高效,却一直未能广泛使用。此技术是利用大肠杆菌自身的同源重组机制,让两段DNA在菌体内发生重组。这两段DNA一般一段是线性化的载体,另一段是含有与线性化载体同源序列的DNA片断。发生重组后,线性化的载体将形成一个闭环的载体,从而能够在大肠杆菌中复制。

发明内容

本发明的目的是提供一种能用同源重组来克隆外源基因或启动子,从而在枯草芽孢杆菌中整合表达的载体的构建及其应用。构建一个从pMLK83改造而来的新的整合载体,利于将克隆在常用载体puc18、puc19或puc57中的外源基因或启动子通过同源重组的方法克隆到这个整合载体,最终实现外源基因或启动子在枯草芽孢杆菌中的整合表达。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

一种能用同源重组来克隆外源DNA的枯草芽孢杆菌整合载体pMLK83-BN,其序列如下:

1   GTCGACGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACGGAT

51  CCTTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA TAGCGGTGGC

101 GGCCGCTCTA GTTAAGGAGG TGATCTAGAA TTCATGGTCC GTCCTGTAGA

151 AACCCCAACC CGTGAAATCA AAAAACTCGA CGGCCTGTGG GCATTCAGTC

201 TGGATCGCGA AAACTGTGGA ATTGATCAGC GTTGGTGGGA AAGCGCGTTA

251 CAAGAAAGCC GGGCAATTGC TGTGCCAGGC AGTTTTAACG ATCAGTTCGC

301 CGATGCAGAT ATTCGTAATT ATGCGGGCAA CGTCTGGTAT CAGCGCGAAG

351 TCTTTATACC GAAAGGTTGG GCAGGCCAGC GTATCGTGCT GCGTTTCGAT

401 GCGGTCACTC ATTACGGCAA AGTGTGGGTC AATAATCAGG AAGTGATGGA

451 GCATCAGGGC GGCTATACGC CATTTGAAGC CGATGTCACG CCGTATGTTA

501 TTGCCGGGAA AAGTGTACGT ATCACCGTTT GTGTGAACAA CGAACTGAAC

551 TGGCAGACTA TCCCGCCGGG AATGGTGATT ACCGAC AAA ACGGCAAGAA

601 AAAGCAGTCT TACTTCCATG ATTTCTTTAA CTATGCCGGA ATCCATCGCA

651 GCGTAATGCT CTACACCACG CCGAACACCT GGGTGGACGA TATCACCGTG

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