[发明专利]一种基于热激蛋白基因辅助选育耐高温海带品种的方法

权利要求书

1.一种基于热激蛋白基因辅助选育耐高温海带品种的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）在线对海带的表达序列标签进行功能注释，搜索具有热激蛋白功能的基因片段；（2）提取海带总RNA，利用热激蛋白基因片段设计用于扩增基因全长的引物，并通过cDNA末端快速扩增技术克隆得到cDNA全长；（3）分析得到的全长序列，在其保守区域设计用于荧光定量PCR的引物及探针；（4）提取海带基因组DNA，倍比稀释，制作荧光定量PCR标准品，使用荧光定量PCR引物对标准品进行扩增，建立标准曲线；（5）以海带基因组中单拷贝的海藻糖合成酶基因，即TPS基因为内标，设计其引物和探针，并且采用与步骤（4）相同的方法建立内标的标准曲线；（6）进行荧光定量PCR，根据待测热激蛋白基因与内标TPS基因的标准曲线计算两者起始模板数，内标基因拷贝数为已知，根据内标基因拷贝数进一步计算热激蛋白基因拷贝数；（7）利用上述方法对已知耐高温海带品种与对照品种进行荧光定量检测，设置三组重复，分别计算耐高温海带与对照海带热激蛋白基因的拷贝数，从而建立热激蛋白基因拷贝数与耐高温性状的关联；（8）使用同一对荧光定量PCR引物在育种群体中进行筛选，检测扩增产物的拷贝数，选择具有耐高温性状的个体。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述用于扩增基因全长的引物分别为上游特异引物GSP1序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TTCTTGGCTTCAACTCTGT-3’和下游特异引物GSP 2序列如SEQ ID NO.2所示：5’-CTCGTGGTGTTCCTCAAA-3’。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中所述用于荧光定量PCR的引物及探针分别为正向引物如SEQ ID NO.3所示：5’-TTGTCGGCTTTCATATTCG-3’；反向引物如SEQ ID NO.4所示：5’-CCCTCGTGGTGTTCCTCA-3’ ；荧光探针序列如SEQ ID NO.5所示：5’-FTCTAACCATTTGATTGP-3’。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中所述内标TPS基因荧光定量PCR引物序列分别为正向引物如SEQ ID NO.6所示：5’-GTTCTTCTTAAGCTTCCTCAC-3’ ；反向引物如SEQ ID NO.7所示：5’-CAAGAAGAATTCGAAGGAGTG-3’；内标TPS基因荧光探针序列如SEQ ID NO.8所示5’-FCATGATGCTGTACAGCGCAAGP-3’。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述荧光探针序列中F为荧光报告基因，P为荧光淬灭基团。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述荧光探针序列中F为荧光报告基因，P为荧光淬灭基团。