[发明专利]一种基于热激蛋白基因辅助选育耐高温海带品种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海带育种方法，具体的说是一种基于热激蛋白基因辅助选育耐高温海带品种的方法。

背景技术

海带是世界性的大型经济海藻，也是我国海水养殖业的重要支柱产业之一，目前我国海带养殖产量及规模均居世界首位。海带经济价值高，不仅是一种营养丰富的绿色食品，也是化工、轻工业和海洋药物的主要原料。近几年国内外研究还发现海带中含有一些有益于人体的生理活性物质，如多烯酸、氨基乙磺酸、多糖以及抗肿瘤细胞活性成分等。其综合利用价值越来越受到人们的重视。

自20世纪60年代我国率先开展了海带育种工作以来，有关研究一直走在世界前列。但是海带是冷水性的大型经济海藻，在养殖生产中，现有养殖海带对高温（21±1℃）的抗性低，易造成烂叶，影响海带产量并影响低成品菜的一级品加工率；其收获期集中在6-7月份，采收压力大，不利于海带加工生产；若提前收割（5月下旬）则海带厚成较差，不仅影响总体养殖产量，而且干物质积累不好，褐藻胶、甘露醇含量较低；海带等大型海藻是鲍养殖的天然饵料，但其在高温季节通常以微型的生殖细胞形式度夏，在每年8-9月期间因无法提供养殖鲍鲜活饵料，给养鲍业带来一定损失。

因此在海带养殖过程中须培育耐高温新品种，以延长海带养殖时间。目前海带育种过程中，鉴别和筛选子代的方法主要是依靠其表型性状，但从整个育种周期来看，这种以表型性状为选育指标的方法，从亲本筛选到后期育成一般需要5-6年时间，育种周期过长，育种效率有待进一步提高。在基因水平上侦寻和建立生物主要经济性状（尤其是数量性状）标识，进行辅助选种，将会大幅度提高育种的目标性与育种效率。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于热激蛋白（heat shock protein, hsp）基因辅助选育耐高温海带品种的方法，通过建立热激蛋白基因拷贝数与海带耐高温性状的关联，实现基因辅助选育的目标，可以大大提高育种的目标性和效率。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：（1）在线对海带的表达序列标签（Expressed sequence tags, EST）进行功能注释，搜索具有热激蛋白功能的基因片段；（2）提取海带总RNA，利用热激蛋白基因片段设计用于扩增基因全长的引物，并通过cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）克隆得到cDNA全长；（3）分析得到的全长序列，在其保守区域设计用于荧光定量PCR的引物及探针；（4）提取海带基因组DNA，倍比稀释，制作荧光定量PCR标准品，使用荧光定量PCR引物对标准品进行扩增，建立标准曲线；（5）以海带基因组中单拷贝的海藻糖合成酶基因，即TPS基因为内标，设计其引物和探针，并且采用与步骤（4）相同的方法建立内标的标准曲线；（6）进行荧光定量PCR，根据待测热激蛋白基因与内标TPS基因的标准曲线计算两者起始模板数，内标基因拷贝数为已知，可根据内标基因拷贝数进一步计算热激蛋白基因拷贝数；（7）利用上述方法对已知耐高温海带品种与对照品种进行荧光定量检测，设置三组重复，分别计算耐高温海带与对照海带热激蛋白基因的拷贝数，从而建立热激蛋白基因拷贝数与耐高温性状的关联；（8）使用同一对荧光定量PCR引物在育种群体中进行筛选，检测扩增产物的拷贝数，选择具有耐高温性状的个体。

所述的对EST序列进行功能注释主要是通过BLAST程序与蛋白质序列数据库进行比对(E值<1e-5)，并选取最佳注释。蛋白质数据库包括SwissProt、KEGG、GenBank非冗余蛋白数据库Nr。

所述海带总RNA的提取可以采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的方法，将冻存的藻体于液氮中研磨呈粉末状，转移到CTAB缓冲液中，65℃水浴5min，氯仿抽提两次，酚：氯仿(24:1)抽提一次，2倍体积无水乙醇沉淀RNA，RNA溶解在1‰DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中，加入DNase除去DNA后用氯仿抽提两遍，加入两倍体积无水乙醇沉淀RNA，干燥后的RNA重新溶解在DEPC水中。CTAB缓冲液组成为2% CTAB，2.0 mol/L NaCl，20 nmol/L EDTA，100mmol/L Tris-硼酸（pH8.0），2% PVP，2%β-巯基乙醇。