[发明专利]筛选鼠李糖脂产生菌的方法及所用培养基

说明书

技术领域

本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，以及利用该培养基筛选鼠李糖脂产生菌的方法，能够筛选出可高产鼠李糖脂、显著提高微生物采油效率的菌株，提高筛选率。

背景技术

鼠李糖脂(RL)是目前研究较多的一种生物表面活性剂，具有乳化、增溶、降低界面张力等功能，低毒、易生物降解，在石油化工、石油开采、生物医药、食品及环境保护等领域有很大应用前景。目前世界范围内，研究最多的产鼠李糖脂最高的菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，且多种铜绿假单胞菌可以利用不同碳源生成鼠李糖脂，其制备主要通过微生物发酵，再从发酵液中提取得到。在微生物采油中，鼠李糖脂是一种非常有效的驱油剂，铜绿假单胞菌被普遍认为是微生物采油的有效功能菌。国内经微生物发酵得到的鼠李糖脂产量较低，从发酵液中分离提取鼠李糖脂的工艺复杂、生产成本偏高，限制了其规模化生产及应用。如CN1891831A公开的RL最大产量仅为23g/L，时进钢等在专利中公开的发酵液中RL的质量浓度为30～40g/L。因此，提高发酵液中的鼠李糖脂产量，降低提取成本，对鼠李糖脂的推广应用很有意义，关键就在于高产鼠李糖脂的菌种和发酵工艺。

然而在自然界，筛选产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌具有随机性，尤其是在石油微生物开采领域，采用目前文献上提及的方法和已存在的筛选方法，从油藏地层水中筛选铜绿假单胞菌具有随机性，不能针对性地筛选出铜绿假单胞菌，选择性差，筛选率低。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，利用该培养基能有效地从含有鼠李糖脂产生菌的菌源中筛选出鼠李糖脂产生菌，提高筛选率。

本发明的另一目的在于提供所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种筛选鼠李糖脂产生菌的方法，该方法准确度高，所得菌种鼠李糖脂产量高。

本发明的另一目的在于提供按照所述的方法筛选得到的鼠李糖脂产生菌。

一方面，本发明提供了一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，该培养基中是以液体石蜡为碳源，并添加绿脓素作为抑制剂。

与现有技术相比，本发明的方法独有之处在于：①在筛选过程中，所用的富集培养基以液体石蜡为唯一碳源，保证了所得到的菌株能够以烃类为碳源，而以烃类为碳源能够促进生物表面活性剂的合成；②在筛选过程中，富集培养基中加入了绿脓素，这是一种铜绿假单胞菌在生长过程中合成的特有色素，对其他细菌具有抑制生长的作用，从而保证筛选的准确性和选择性。

根据本发明的具体实施方案，本发明的用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基为液体培养基，其中，液体石蜡的含量为5～15g/L，绿脓素的含量为5～15g/L。

根据本发明的具体实施方案，本发明的用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基中包括：NaNO₃ 2～4g/L，Na₂HPO₄ 1～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0～1g/L，NaCl 0～5g/L，酵母粉0～1g/L，液体石蜡5～15g/L，绿脓素5～15g/L，pH 7.2～7.5。

另一方面，本发明还提供了所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种筛选鼠李糖脂产生菌的方法，其中应用本发明所述的培养基作为富集培养基。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法包括步骤：

a.以油田油藏地层水作为菌种筛选源，接种于本发明所述的以液体石蜡为碳源并添加绿脓素作为抑制剂的培养基中，30～38℃培养100～200h，得到菌种培养液；

b.将步骤a中得到的菌种培养液涂布于(可根据培养基的浓度和实际培养情况对培养液进行适当稀释后再涂布，一般要求稀释在10⁸，为了节约时间和减少培养基的浪费可选择10⁴、10⁵、10⁶梯度稀释)溶血琼脂平板培养基或LB琼脂平板培养基上，34～37℃培养24～48h，根据菌落形态挑选菌种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法中，所述步骤a中油田油藏地层水与所述培养基的接种比例可以为1∶4～10(v/v)，具体可根据油水样是否新鲜以及地层水中菌体数量适当调整。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法中，是挑选具有以下菌落形态的菌种：