[发明专利]一种高纯度两性霉素B的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种利用两性霉素B发酵液制备高纯度两性霉素B的方法。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B)是由结节性链霉菌(Streptomyces nodosus)产生的一种多烯大环内酯类抗生素，是一种黄色或橙黄色结晶粉。分子式为C₄₆H₇₃NO₁₇，分子量为924.09。两性霉素B的化学结构已经在20世纪70年代，通过X-ray衍射技术得到了确证(Mechlinski，W.；C.P.Schaffner，P.Gann.& g.Avitabile，Structure and absolute configuration of the polyene macrolide antibiotic amphotericin B.Tetrahedron letter 44：3873-3876(1970)，化学结构式如下：

两性霉素B临床上主要用于治疗系统性真菌感染，两性霉素B的抗真菌原理为通过与真菌细胞膜上麦角固醇特异性结合，从而分解细胞膜，使得细胞内容物外泄而导致真菌细胞死亡(Norman，A.W.，Spielvogel，A.M.，Wong，R.G.，Plyene antibiotic-sterol interaction.Adv Lipid Res 14：127-171(1976))，用于隐球菌、球孢子菌、念球菌、毛霉菌、曲菌等引起的全身感染，是一种疗效好但毒性也大的药物。

两性霉素B传统剂型的溶血性和肾松懈性副作用曾一度限制了该药品的使用，但是近年来AmB脂质体的发明，在保持抗菌活性不变的前提下，大大降低了毒副作用，使得该药物在临床上重新得到了广泛应用(Subira M，Martino R，et al，Low-dose amphotericin B lipid complex vs.conventional amphotericin amphotericin B for empirical antifungal therapy of neutropenic fever in patients with hematologic malignancies-a randomized，controlled trial.Eur J Haematol 72：342-7(2004))。正如两性霉素B的标准物质中存在杂质一样，两性霉素B药品及脂质体中杂质的控制亦不容忽视。两性霉素B已经被美国药典29版(United States Pharmacopoeia 24th Edition No.134)、英国药典2005版(British Pharmacopoeia 2005 Edition No.141)以及中国药典2005版(Chinese Pharmacopoeia 2005 version)收载。两性霉素B作为微生物代谢产物，具有生物活性强、结构稳定性差、有关物质多等特点，所以其质量的稳定可控和质量的优劣对于保障人民的用药安全至关重要。

两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，含有七个相连的双键结构，在其C-18上带有一羧基基团，决定了两性霉素B几乎不溶于水，在二甲亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。由于两性霉素B的溶解特性，很多用于两性霉素B分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。

关于两性霉素B的分离纯化工艺，付瑞良等(抗生素工艺学下编[M].国家医药管理局，1992：28～30)公开了一种两性霉素B的提取方法，采用碱将发酵液的pH值调节至10.0-14.0后，固液分离得到两性霉素B提取液。将两性霉素B提取液酸化调pH值至5.0-7.0，析出50％左右两性霉素B产品。该方法得到的两性霉素B产品纯度较低(含量在50％左右)，即使再经过反复结晶和重结晶，两性霉素B甲酯、两性霉素A及其它单杂的含量仍然较高。

美国专利US4748117报道了一种不加有机溶剂而直接从发酵液中回收两性霉素B的分离方法。该方法在两性霉素B发酵结束时，首先将发酵液加热到120℃诱导两性霉素B晶体形成，然后冷却并保持温度为35℃，再加入溶菌酶溶解发酵液中的菌丝体，然后利用重力离心，从而获得两性霉素B。由于该工艺对发酵液质量和分离设备要求严格，没有脱热源工序，得到的两性霉素B纯度低。