[发明专利]杨桃细菌性斑点病原细菌分子检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杨桃细菌性斑点病原细菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术

杨桃细菌性斑点病是由杨桃细菌性斑点病原细菌（Pseudomonas syringae pv. averrhoi）侵染引起的一种病害。杨桃(Carambola)系酢浆草科，属于热带、亚热带常绿乔木果树。在我国广东、海南等省普遍栽种。近年，在广东、海南两省一些杨桃种植园或苗圃发现一种导致严重落叶的叶斑病，切取叶片病斑组织作显微镜检查，发现有细菌溢流，认为是一种细菌性病害，该病害在国内外尚未见报道，因此，有必要对该病害进行研究，为防治该病提供理论依据（文衍堂，黄智辉，1995）。在台湾，本病害于1997年11月在苗栗县卓兰镇首次被发现，经过全台湾主要杨桃产区调查结果，目前仅在栗县卓兰镇、台中县东势镇、石冈乡、新社乡、南投县国姓乡及彰化县员林镇等地发生。

杨桃细菌性斑点病全年发生，可感染叶片、枝条以及果实，但以叶片最为严重。叶片患病时，初期产生暗绿色水浸状斑点。以后扩大为紫红色的斑点，病斑周围有明显的黄色晕环，严重时叶片黄化并提前落叶。枝条患病时，呈暗褐色坏疽斑点。果实患病时，初期产生紫褐色大小不一的坏疽病斑，病斑周围有黄色晕环，严重时果实畸形。该病的传染途径：患病的叶片、枝条以及果实为主要感染源，病原菌可借由雨水飞溅传播，并经由气孔以及伤口侵入感染，因此，春雨、梅雨以及台风季节本病发生较为严重。

自从发现杨桃细菌性斑点病原细菌以来，台湾的研究人员便对其检测技术进行研究。此病害可根据发病病症、病原菌的生理生化特性以及回接试验来判定，但此传统方法耗时且费力。近年来随着分子生物技术的进步，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）常被应用于动植物病害的诊断，以及病原菌的鉴定与侦测，台湾宋氏与徐氏（2002）已发展PCR技术应用于此病害的诊断鉴定。

植物病原生物的分子检测技术（以PCR技术为平台）是当前该领域的发展方向，许多重要病原生物都已经建立了分子检测技术，越来越多的分子检测试剂盒已经或正在被研制。我国虽然在植物病原生物分子检测技术方面起步较晚，但目前也研制出了许多用于植物病原生物检测的技术，尤其是一些拥有自主知识产权的检测方法，并将之投入到商业生产和应用中。但在杨桃细菌性斑点病检测方面国内至今还未见有分子检测技术的系统研究，更没有相关检测试剂盒的研制和推广。

发明内容：

本发明是针对现有技术中杨桃细菌性斑点病菌的生物学检测方法所需周期长、目前杨桃细菌性斑点病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供了一种杨桃细菌性斑点病菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的杨桃细菌性斑点病菌的快速分子检测诊断的方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．根据杨桃细菌性斑点病菌ITS基因序列的特异性，设计了对杨桃细菌性斑点病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物　PSaveF: 5'----CTTATCGACGACTCAGCTGCG----3'

下游引物　PSaveR: 5'----TCATGCGTTGATCGTCAGGATC----3'。

2． 杨桃细菌性斑点病菌特异分子检测体系的建立

（1）采用酚、氯仿法,从植物组织的叶片或果实中提取DNA；

（2）PCR扩增：以提取的DNA为模板进行PCR扩增；PCR反应体系25ul，包括2.5ul 10×PCR反应缓冲液，25mM Mg²⁺ 2ul，2.5mM dNTPs 2ul, 0.5U Taq DNA聚合酶，10uM引物PSaveF / PSaveR各0.4ul和10ng模板DNA, d.d.H₂O补足25ul。PCR反应条件为: 95℃ 预变性3min； 94℃变性 1min, 60℃退火 30 sec ,72℃延伸45 sec 共30个循环；72 ℃延伸10 min。

（3）然后取PCR产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果；所述琼脂糖电泳分离采用1.5%琼脂糖电泳。

（4）如果能特异性地扩增出373bp产物时，即可判断所述的植株组织样品中存在杨桃细菌性斑点病菌；否则所述的植株组织样品中未存在杨桃细菌性斑点病菌。