[发明专利]大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒

权利要求书

1.一种大肠癌特异性抗原肽，其特征在于，所述大肠癌特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8，或SEQ IDNo.10所示。

2.一种权利要求1所述的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其特征在于，由噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述噬菌体为T7噬菌体。

4.一种大肠癌特异性抗原肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括：

a)构建大肠癌噬菌体展示肽库：

抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，应用oligodT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加Ecol Ⅰ和Hind Ⅲ接头，双酶切后去除小片断，然后接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，构建大肠癌噬菌体展示肽库；

b)亲和筛选大肠癌特异抗原肽：

取10μl A/G的琼脂糖珠置于一1.5ml离心管中，用500μl pH7.4的PBS洗2次，1％BSA 4℃封闭1h，琼脂糖珠分别与15μl大肠癌患者及对照患者的血浆4℃孵育过夜，500μl PBS洗涤3次后，用10μl PBS溶解富集到的抗体，10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管，取所述噬菌体展示肽库扩增液20μl，先与20μl的非大肠癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并用100μl 1％SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选；

c)血清学筛选大肠癌早期检测分子标志：

c1)混合血样初筛：

筛选后得到的噬菌体展示肽库用LB液体培养基1∶10⁸稀释后，取100μl噬菌体液、250μl新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55℃的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37℃温箱孵育4小时，可见有单个的噬菌斑形成，每1个1.5ml离心管中，加入1ml新摇好的细菌BLT5403，随机挑取单个的、边界清晰的噬菌体克隆于1个1.5ml离心管中，共随机挑选噬菌体克隆2000个，并按顺序编号，挑好的噬菌体置37℃恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止，挑选好的噬菌体克隆置4℃保存，用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体克隆的插入片段，挑取扩增片段200bp以上的噬菌体克隆进行ELISA实验进一步筛选；

所述ELISA实验的步骤为：

将T7TAILER抗体用pH7.4的PBS按1∶1000来稀释，每孔取100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜；

用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干；采用200μl 2％BSA/PBS于26℃封闭2小时；

用洗液洗板，每孔300μl，洗四次，每次约1分钟，拍干；加入用1％BSA以1∶5比例稀释的噬菌体100μl，每个标本加4孔；每次试验均加入没有插入片段的空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔，室温孵育2小时，弃去孔内液体，拍干；

每个噬菌体标本加入100μl 1％BSA以1∶500比例稀释的大肠癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔，所用大肠癌组、对照组的混合血浆的患者信息同步骤b)亲和筛选所用的患者，室温孵育1小时；

洗板后每孔加入100μl 1∶10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，于26℃室温孵育1小时；

洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37℃孵育5分钟，加入终止液25μl，立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果，每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性结果；样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值＜2.0，判断为阴性结果；找出与大肠癌混合血清反应为阳性，而与对照混合血清反应为阴性的有意义的噬菌体克隆；

c2)独立血清复筛：

将经步骤c1)初筛后的所述有意义的噬菌体克隆应用30例大肠癌患者血清及30例健康对照血清进行ELISA复筛，步骤同c1中所述ELISA实验的步骤，不同之处在于筛选所用的血清为独立的，而不是混合血清，对比所述有意义的噬菌体克隆与各大肠癌患者血清及对照血清的反应性，应用独立样本t检验的方法，挑选出与30例大肠癌血清及30例健康对照血清的反应数据具有显著差异的噬菌体肽克隆；

c3)大肠癌特异性抗原肽重组载体的诊断模块的获得：

应用dige R软件采用随机森林法对所有独立血清样本进行2000次随机抽样，根据各噬菌体区分大肠癌血清的能力，对步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体的筛选能力从高到低进行排序；采用贝叶斯双变量模型，依次检验噬菌体联合检测的效果，按联合数量最少、且联合检测的灵敏度与特异性与步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体联合检测的灵敏度与特异性最接近的标准，得到5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其上插入的cDNA片段的序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9所示。