[发明专利]大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医用检测试剂技术领域，涉及一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体及构建方法、大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及操作方法。

背景技术

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率位于第三，在我国则有逐年上升的趋势，在上海已位居恶性肿瘤发病率第二位。根据中国卫生部卫生信息2007年统计数据表明，发病率占全部恶性肿瘤的第3位，大肠癌死亡率为10.25/10万，占癌症致死第5位。大肠癌根据TNM分期不同可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，各期大肠癌预后相差很大，早期大肠癌复发及转移率低，预后良好，术后5年生存率可达97％，进展期大肠癌术后5年生存率仅为40％-50％。因此探索大肠癌早期诊断和筛查方法非常重要。

目前常用的大肠癌检查方法有直肠指诊、粪便隐血实验、结肠镜及影像学检查。而这些检查都存在有不足之处，直肠指诊范围局限，粪隐血实验敏感性及特异性差，结肠镜检查有一定痛苦，患者较难接受，影像学检查对于早期肿瘤不敏感。目前常用的肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)，CA19-9等指标缺乏敏感性及特异性，不能对大肠癌进行早期诊断。因此建立能高通量诊断大肠癌的特异检查方法是当务之急。

发明内容

肿瘤发生后，肿瘤细胞表面的特征抗原或肿瘤细胞分泌的特征抗原刺激机体产生抗体，这些抗体可存在于尚无症状的早期肿瘤患者血清中。通过寻找大肠癌特征抗原，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而做为分子标志，可以早期发现大肠癌，与现行的其他方法相比，具有微创、简单、经济、敏感度及特异度高等特点，方便用于社区人群的筛查，从而达到早期检测大肠癌的目的。

本发明的第一个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而作为分子标志来早期发现大肠癌。

本发明的第二个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体。

本发明的第三个目的在于提供该表达载体的构建方法。

本发明的第四个目的在于提供包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，用于检测早期大肠癌。

本发明的第五个目的在于提供该试剂盒的制备及其操作方法。

本发明提供的大肠癌特异性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8，或SEQ ID No.10所示。

本发明提供的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，由噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示。优选的，所述噬菌体为T7噬菌体。

本发明提供的大肠癌特异性抗原肽表达载体的构建方法，包括：

a)构建大肠癌噬菌体展示肽库：

抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，应用oligodT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加Ecol Ⅰ和Hind Ⅲ接头，双酶切后去除小片断，然后接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，构建大肠癌噬菌体展示肽库；

b)亲和筛选大肠癌特异抗原肽：

取10μl A/G的琼脂糖珠置于一1.5ml离心管中，用pH7.4的500μl PBS洗2次，1％BSA 4℃封闭1h，琼脂糖珠分别与15μl大肠癌患者及对照患者的血浆4℃孵育过夜，500μl PBS洗涤3次后，用10μl PBS溶解富集到的抗体，10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管，取所述噬菌体展示肽库扩增液20μl，先与20μl的非大肠癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并用100μl 1％SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选；

c)血清学筛选大肠癌早期检测分子标志：

c1)混合血样初筛：