[发明专利]利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法

权利要求书

1.培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：

(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；

(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括：

(3)收集步骤(2)得到的甘草毛状根和其培养液。

3.权利要求1或2所述的方法，其中吐温是吐温-80，优选液体培养基中吐温-80的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)。

4.权利要求1或2所述的方法，其中液体培养基为MS液体培养基，优选其中培养的条件为20～30℃避光摇床培养10～20天，更优选为25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养15天.。

5.权利要求1或2所述的方法，其能提高黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量，尤其能提高甘草毛状根培养液中黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量5倍以上，优选能提高10倍以上。

6.权利要求1至5之任一所述的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法中的应用。

7.制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行权利要求1至5之任一所述的方法，获得甘草毛状根；

(2)干燥步骤(1)得到的甘草毛状根，用其重量10-20倍的水于60℃-100℃提取2-8小时，保留固体部分并将固体部分于烘箱中以30℃-60℃干燥；

(3)干燥步骤(2)得到的固体部分，并用50-95％(v/v)乙醇于60℃-100℃提取1-2次，洗涤提取的残渣，合并提取液及洗涤液，保留液体部分并浓缩和/或干燥。

8.制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行权利要求1至4之任一所述的方法，获得甘草毛状根培养液；

(2)将任选经浓缩的步骤(1)得到的培养液上样于聚酰胺层析柱，用至少两种0～85％(v/v)乙醇水溶液按乙醇浓度由低到高的顺序依次进行洗脱，收集用浓度不小于60％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液并浓缩和/或干燥。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，依次用水、10～50％(v/v)乙醇和60～95％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱。

10.权利要求9或8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，依次分别用2-7倍柱床体积的水、30％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇和70％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱，收集用70％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液。

11.权利要求7至10之任一所述的方法制备的甘草总黄酮，其中黄酮含量大于24％，更优选其中黄酮含量大于60％，也优选其中还包括甘草查尔酮A和光甘草定，例如，所述甘草总黄酮的HPLC图谱可以如图1、2或3的70％乙醇洗脱液的图谱所示。

12.权利要求11所述的甘草总黄酮，其中甘草查尔酮A和光甘草定的量相较权利要求7至9之任一所述的方法中步骤(1)得到的培养液中的甘草查尔酮A和光甘草定的量，基本没有减少，优选前者的量是后者的90％以上，更优选95％以上。

13.根据权利要求1-12，本发明包含一种植物毛状根培养及经含有吐温的诱导剂共培养体系以提高植物黄酮类目标物合成并释放到液体培养基中的植物黄酮类物质的生产方法。所述方法包含但不限于甘草。