[发明专利]利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及甘草毛状根的培养方法以及利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法。另外，本发明还涉及一种由上述制备方法得到的甘草总黄酮及其医药应用。

背景技术

甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“百草之王”。近年来人们发现甘草中含有的各种黄酮是除了甘草酸外的另一类活性物质，甘草总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋、抗炎、抗溃疡、抗衰老等药理作用，需求强劲，目前已应用到医药、食品、保健品以及化妆品等各个领域。

随着甘草的不断开发利用，野生资源采挖过度，给自然环境和生态资源造成了巨大的破坏。2001年9月我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，并且禁止使用野生甘草及其产品作为保健食品成分，甘草供需矛盾更加突出。甘草资源的匮乏及其应用的限制成为限制甘草应用的瓶颈，迫切需要开发甘草活性成分的新来源、新途径。

利用甘草毛状根生产甘草总黄酮是一条具有良好前景的有效途径，且有许多适应工业化生产的特点，如成本低，生长快，生产能力稳定等。但是甘草毛状根中的黄酮含量远低于生药根的含量，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化，如张荫麟等报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39％，远低于生药根中的黄酮含量。目前对影响毛状根中黄酮含量的因素研究较多，如杨睿等报道了茉莉酸甲酯和水杨酸对水母雪莲毛状根中黄酮类化合物含量的影响，在毛状根接种后第10d添加浓度为0.02mmol/L的茉莉酸甲酯，黄酮类化合物比对照提高34.1％；在毛状根接种后第15d添加浓度为0.03mmol/L的水杨酸时，黄酮类化合物比对照提高52.9％。但是目前对于毛状根培养液中黄酮的含量、影响因素及如何利用研究的较少，尽管于树宏等报道了吐温-80对野葛毛状根中异黄酮(isoflavone)含量的影响，但是不涉及对甘草的研究，更不涉及对甘草毛状根及其培养液中黄酮(flavone)含量的研究和启示。另外，吐温作为常用的药用辅剂，在中药复方制剂中作为辅料可以与甘草或其提取物等活性成分配制在一起构成药物组合物，如中国专利95108283、02100222、和200610035831等，但是在这些药物中吐温仅仅是作为药用辅剂而存在的。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地发现了，利用含吐温的液体培养基培养5天以上的长时间，能够显著提高甘草毛状根组织培养得到的毛状根及其培养液中黄酮类化合物的含量，尤其是能够促使总黄酮从甘草的毛状根释放到培养液中，大大提高培养液中活性成分的含量；另外，本发明人还发现利用简单的乙醇梯度洗脱聚酰胺层析柱，即可制备高纯度的甘草总黄酮。这样从毛状根及其培养液中获取甘草总黄酮，能够有效避免资源的浪费，更为令人意想不到的是，本发明的甘草总黄酮的诸如体外肿瘤杀伤等效果甚至优于现有文献报道的甘草总黄酮。

发明内容

本发明的目的在于，为解决甘草资源短缺与甘草需求的矛盾，以达到产业化生产甘草黄酮，替代甘草资源的目标，提供了利用组织培养的甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法，提高了其中甘草总黄酮的含量，并进一步提供了制备或提纯这些甘草总黄酮的方法。因此，本发明提供了甘草毛状根的培养方法、制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的应用、制备甘草总黄酮的方法以及由其制备得到的甘草总黄酮产品。

具体而言，在第一方面，本发明提供了培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：

(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；

(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。