[发明专利]中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法

权利要求书

1.中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取中国黄连茎段、叶片、叶柄作为诱导愈伤组织的外植体；

(2)常规清洗和消毒后，在无菌条件下将茎切成厚0.2cm薄片，叶片切成0.5×0.5cm小块，叶柄切成0.5cm小段；

(3)选用MS、B5、6，7-V作为黄连愈伤组织诱导的基本培养基；

(4)将步骤(2)所述备好的外植体接种于基本培养基附加0.5～3.0mg/L 2，4-D和0.1～0.5mg/L KT的固体培养基上，所有培养基的pH均为5.0～6.0，蔗糖1～8％，琼脂0.6～0.7％。培养温度21±1℃，暗培养；

(5)在步骤(4)所述的培养基上，2～4周进行一次愈伤组织的继代培养，培养条件同步骤(4)；

(6)中国黄连细胞的悬浮培养，经3～5次继代后，选取较松散的愈伤组织分散均匀，接种于步骤(4)所述不加琼脂的液体培养基内，置于恒温振荡器上进行液体悬浮培养，转速100～130转/分钟，培养温度23±1℃；

(7)小檗碱提取：培养细胞收获后，称取鲜重与干重，计算产率和生长速率。精密称取于60℃下干燥至恒重的样品，甲醇回流提取，定容过滤后，测定小檗碱含量。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括筛选优良高产细胞系的步骤；在步骤(6)所述的中国黄连细胞悬浮培养物中，获得游离细胞和细胞聚集体；将细胞聚集体分别经由500μm、250μm和100μm网筛的滤过，然后混悬于液体培养基，再与熔化的固体培养基混均，置于平板中进行培养，接种中国黄连细胞的浓度为10^3～5细胞/ml；挑取细胞克隆再转代进行液体悬浮培养，取其培养物分析小檗碱含量，筛选出单位小檗碱含量高的中国黄连细胞株。

3.根据权利要求1与2所述的方法，还进一步包括优化中国黄连细胞悬浮培养条件的步骤：

1)碳源：从权利要求1与2步骤中，培养基中较为适合中国黄连细胞生长且提高小檗碱含量的蔗糖浓度为1～8％；

2)氮源：从权利要求1与2步骤中，为促进中国黄连细胞生长和提高小檗碱含量，在基本培养基中补加0.1～1.0g/LNH₄NO₃；

3)激素配比：从权利要求1与2步骤中，培养基中既适合中国黄连细胞生长又提高小檗碱含量的激素配比组合分别为0.5～3.0mg/L 2，4-D和0.1～0.5mg/L KT、NAA 0.1～2mg/L和0.1～0.5mg/L KT。