[发明专利]中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法。

背景技术

植物细胞不仅具有形态建成全能性，同时还具有物质代谢全能性。利用植物细胞全能性发展起来的细胞培养技术是解决药用植物资源日益匮乏，实现药用次生代谢产物工业化的有效手段。植物细胞悬浮培养由于其分散性好，细胞形状及细胞团大小较均匀，而且生长迅速，重复性好，易于控制等有利因素，已被应用于植物次生代谢物的大规模生产。增加植物细胞培养物中次生代谢产物产量的方法可通过改变培养基成分及其浓度、生长调节剂的优化、细胞克隆的选择等手段来实现。植物细胞在一定培养条件下，可提高目标次生代谢产物的产率，不受自然资源的限制，易于工业化生产并且降低提取物中的杂质成分，便于分离纯化，降低产品成本。

黄连是中国及其他亚洲国家常用的重要药材。中国黄连(Coptis chinensis Franch)为毛莨科多年生草本植物，其根茎含多种生物碱，主要为小檗碱(Berberine)，又名黄连素。小檗碱具有抗病原微生物、止泻、抗心律失常、降压、改善心力衰竭、改善胰岛素抵抗、降血脂、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用。中国黄连生境较为严格，且生长缓慢，一般4～6年才能采集入药。由于长期缺少有计划的采挖致使野生黄连濒危，已造成该植物资源枯竭，虽有引种栽培，却要占用大量农田，而且中国黄连的生长周期长，加之受环境的制约，使得小檗碱含量和质量不稳定；少量采用化学合成的方法，则存在工艺流程复杂、成本高、污染环境等诸多问题。

二十世纪七十年代，日本研究人员对日本黄连(Coptis japonica)进行了大量的诱导愈伤组织和细胞培养工作，已筛选出稳定高产的细胞系，用于工业化生产小檗碱。我国虽已建立了中国黄连的人工扩繁种植体系，并进行相关的组织培养研究，目前尚未能够通过细胞培养实现小檗碱的工业化生产。在当今人类面临日益严重的资源短缺、能源危机、环境污染情况下，通过大规模中国黄连细胞的悬浮培养进行小檗碱的工业化生产具有重要的开发应用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对目前由中国黄连制备小檗碱所存在的资源与生产技术问题，提供一种中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法，利用该方法生产小檗碱具有工艺流程简单，生产周期短，生产能耗低且无污染，生产过程不受地域、土壤、水质、季节、气候等自然环境因素影响等优点。

本发明是建立适于中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法包括外植体制备、从外植体诱导愈伤组织、继代培养愈伤组织、悬浮培养中国黄连细胞、优良高产细胞系的筛选、细胞悬浮培养条件的优化等步骤。

(一)、外植体的制备：取中国黄连茎段、叶片、叶柄作为外植体，常规清洗和消毒后，在无菌条件下将茎切成厚0.2cm薄片，叶片切成0.5×0.5cm小块，叶柄切成0.5cm小段。

(二)、愈伤组织的诱导：选用MS、B5、6，7-V作为黄连愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤(一)制备好的外植体接种于基本培养基附加0.5～3.0mg/L 2，4-D和0.1～0.5mg/L KT的固体培养基上，所有培养基的pH均为5.0～6.0，蔗糖1～8％，琼脂0.6～0.7％。培养温度21±1℃，暗培养。

(三)继代培养愈伤组织：在步骤(二)所述的培养基上，2～4周进行一次愈伤组织的继代培养，培养条件同步骤(二)；

(四)、细胞的悬浮培养：经3～5次继代后，选取较松散的愈伤组织分散均匀，接种于步骤(二)所述不加琼脂的液体培养基内，置于恒温振荡器上进行液体悬浮培养，转速100～130转/分钟，培养温度23±1℃。

(五)、小檗碱的提取：培养细胞收获后，称取鲜重与干重，计算产率和生长速率。精密称取于60℃下干燥至恒重的样品粉末，甲醇回流提取，定容过滤后，测定小檗碱含量，如《中国药典》2005年版用HPLC方法检测小檗碱含量。

(六)、优良高产细胞系的筛选；在步骤(三)所述的中国黄连细胞悬浮培养物中，获得游离细胞和细胞聚集体；将细胞聚集体分别经由500μm、250μm和100μm网筛的滤过，然后混悬于液体培养基，再与熔化的固体培养基混均，置于平板中进行培养，接种中国黄连细胞的浓度为10^3～5细胞/ml；挑取细胞克隆再转代进行液体悬浮培养，取其培养物分析小檗碱含量，筛选出单位小檗碱含量高的中国黄连细胞株。

(七)、中国黄连细胞悬浮培养条件的优化：

1)碳源：培养基中较为适合中国黄连细胞生长且提高小檗碱含量的蔗糖浓度为1～8％；