[发明专利]抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的杂交瘤细胞，其特征在于：所述细胞的保藏号为CGMCC NO.4107。

2.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体，其特征在于：由保藏号为CGMCC NO.4107的杂交瘤的细胞所分泌，DON最低检出浓度是9.2μg/L。

3.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的制备方法，其特征在于包括以下依次步骤：

1)偶联物制备

BSA，DON分别与1，3二环基二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联，通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物，DON与BSA摩尔比为50∶1；将DON-BSA偶联物配制成1mg/ml溶液，采用小剂量长周期的免疫方案，对6～8周龄的雌性小鼠；首次免疫用100μg DON-BSA，加入等量完全福氏佐剂；2周后，用100μg DON-BSA，加入等量不完全福氏佐剂；再2周后，用100μg DON-BSA，加入等量不完全福氏佐剂；2周后，强化免疫，50μg DON-BSA溶液脾内免疫，4d后取脾细胞进行融合；

2)细胞融合

将Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶10混合于50mL无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，轻弹管底使细胞充分散开；将离心管置37℃水浴中，缓慢加入37℃预温的50％PEG 0.7mL，1min内加完；于37℃静置90s，缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作用；800r/min离心10min，弃上清液，用含20％小牛血清的HAT选择培养基悬浮沉淀的细胞，调整细胞浓度为2×10⁶/mL，然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养，在融合7～14d后改用HT培养液；逐日观察细胞生长情况，待长至1/3～1/2视野，ELISA法检测上清液中抗体；

3)杂交瘤筛选及抗体检测

以0.5μg/ml DON-BSA、BSA分别为包被抗原，用间接ELISA法筛选融合细胞上清中抗DON单克隆抗体，用DON毒素间接竞争抑制性ELISA法确证单克隆抗体的特异性；以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以融合细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对照；

4)杂交瘤细胞的克隆化

ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔，有限稀释法进行克隆化，经3～4次亚克隆，达到3次100％阳性，建立了1株能稳定分泌DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCCNO.4107，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体DON最低检出浓度是9.2μg/L。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中的应用。

5.如权利要求2所述的杂交瘤细胞，其特征在于：在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中的应用。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：在检测农作物食品中的应用。

7.如权利要求2所述的杂交瘤细胞，其特征在于：在检测农作物食品中的应用。