[发明专利]抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，特别的涉及一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用。 

背景技术：

在我国农产品的诸多污染因素中，真菌毒素是一类重要的天然污染物，由其引起的食源性疾病和食品贸易争端一直是全球关注的热点。其中毒性大、与人类健康关系最密切、对农作物污染最重、分布最广的真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)不仅是赤霉病小麦污染的主要毒素，而且还可以污染玉米、大麦、高粱等谷物，人畜进食被该毒素污染的粮食和饲料后可以引起中毒，产生DON的镰刀菌还是导致水稻恶苗病、蔬菜(如节瓜节瓜枯萎病)等农作物的主要病原菌，因此DON污染不仅是一个重要的食品安全问题，而且在农业上是一个导致农作物减产、品质下降的一个重要因素。因此以研制的抗DON单克隆抗体为基础，创建快速、灵敏、准确的DON的检测方法，不仅对保障食品安全，促进人类健康具有重要意义，而且在优质、抗恶苗病水稻和蔬菜品种的筛选，提高农产品产量和保障质量方面具有重要作用。 

DON污染控制的关键在于现场快速、动态监控毒素水平，摸清毒素在各类农产品中污染的“家底”，而目前我国检测上述毒素方法存在灵敏度低、操作繁琐、接触剧毒标准品、检测方法不适用于批量样品处理、难以满足现场检测要求等缺憾，并已成为制约我国食品工业快速发展和农产品出口贸易的“瓶颈”，迫切需要建立快速、灵敏、适于企业自检和基层现场使用的DON免疫检测技术方法。目前检测DON的免疫方法有酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫胶体金方法和化学发光免疫检测方法(CLIA)。这几种方法的关键是制备特异性强的针对DON的单克隆抗体，并以此为基础利用高亲和力的抗体与抗原之间的特异识别，筛选出最佳免疫检测方法并标准化，从而研制出方便、经济、灵敏、快速、适于基层和现场使用的免疫检测试剂盒。 

由于DON为半抗原，因此只有免疫反应性(与特异性抗体反应)而无免疫原性(不能刺激机体产生抗体)，必须与大分子载体偶联后方可刺激机体产生抗体。目前国内外报道在制备 DON单克隆抗体时用于免疫动物的完全抗原是DON-卵清蛋白(OVA)偶联物，检测用的包被抗原为DON-牛血清白蛋白(BSA)偶联物。而本研究免疫动物和单克隆抗体检测时均用同一种蛋白和DON的偶联物(DON-BSA)、采用载体排除法制备抗DON单克隆抗体的方法国内外未见报道。由于只需合成一种完全抗原，因此该方法虽具有经济、简单、省时的特点，但在技术上较免疫和检测用不同完全抗原的方法要求高、难度大。 

本研究通过细胞融合，免疫抗原和检测抗原均采用DON-BSA，获得了高效分泌抗DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该抗体灵敏度高，特异性强，与DON亲和力高，与其他毒素交叉反应低，为DON检测试剂的研制奠定了基础。 

发明内容：

(一)抗DON单克隆抗体的制备 

1.动物免疫 

将BSA，DON分别与1，3二环基二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联，通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物，采用小剂量长周期的免疫方案。 

2.细胞融合 

将Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶10混合于50mL无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，轻弹管底使细胞充分散开，将离心管置37℃水浴中，缓慢加入37℃预温的50％PEG0.7mL，1min内加完，于37℃静置90s，缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作用。800r/min离心10min，弃上清液，用含20％小牛血清的HAT选择培养基(Gibco公司产品)悬浮沉淀的细胞，调整细胞浓度为2×10⁶/mL，然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养，在融合7～14d后改用HT培养液(Gibco公司产品)，逐日观察细胞生长情况，待长至1/3～1/2视野，ELISA法检测上清液中抗体。 

3.杂交瘤筛选及抗体检测 

本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以0.5μg/ml DON-BSA、BSA分别为 包被抗原，用间接ELISA法筛选融合细胞上清中抗DON单克隆抗体，用DON毒素间接竞争抑制性ELISA法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照。 

4.杂交瘤细胞的克隆化