[发明专利]沙门氏菌的PCR检测方法及引物对

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测技术领域的方法，具体是一种沙门氏菌的PCR检测方法及引物对。

背景技术

近年来，食源性疾病已成为当前突出、广泛的食品安全问题。沙门氏菌(Salmonella)为肠杆菌科沙门氏菌属成员，是条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌。沙门氏菌是细菌性食物中毒中发病率最高的一种，而且几乎所有的血清型都能致病。传统的沙门氏菌检测方法需要经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来确定，这种检测方法虽然结果较为可靠，但是操作复杂，费时费力，通常需要3～5天才能得到检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种沙门氏菌的PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一，根据沙门氏菌基因组DNA序列中的保守序列设计扩增引物；

步骤二，提取待检样品的DNA，PCR扩增；

步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品中是否含有沙门氏菌；所述判断为：若电泳结果出现相应扩增条带，则说明样品中含有沙门氏菌。

优选地，步骤一中，所述保守序列的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，步骤二中，所述引物具体为：正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，步骤二中，所述PCR扩增中，25μL反应体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5uM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液取2～5μL，最后补水至25μL。

优选地，步骤二中，所述PCR扩增中的反应条件为：94℃ 5min，94℃30min，55℃ 30min，72℃ 30min，30个循环，72℃终延伸10min。

优选地，步骤二中，所述扩增条带为516bp条带。

本发明的第二个目的在于提供一种引物对，引物对中正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测沙门氏菌，检测时间可缩短为10小时内，由于无需采用传统方法中必须使用的抗血清，降低了检测成本；同时，本发明的检测方法也可以用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更加具有实用性；本发明的检测靶点具有单一的特异性，检测结果特异，结果判断简单。

附图说明

图1为实施例1中样品检测电泳结果图；

图2为实施例2中不同血清型的沙门氏菌检测电泳结果图；

图3为实施例2中沙门氏菌和其他非沙门氏菌检测电泳结果图；

图4为实施例3中不同浓度DNA扩增后的检测电泳结果图；

图5为实施例4中混合培养物PCR扩增电泳图；

图6为实施例4中沙门氏菌培养物培养后PCR扩增电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中涉及的仪器及试剂为：

Tris-EDTA(TE)缓冲液，10×buffer，MgCl₂，dNTP，Taq酶均购于捷瑞生物工程上海有限公司；

引物，琼脂糖凝胶，PTC-200PCR基因扩增仪购于美国M.J.Research公司；

5415D台式离心机：Eppendorf公司；电泳仪：北京六一仪器厂；电泳槽、TAT凝胶成像系统：BIO-RAD公司；

以下实施例中涉及的各种菌株均可通过公开的市售渠道获得。

实施例1

1、选择沙门氏菌基因组DNA序列中的保守序列并设计引物

从沙门氏菌基因组DNA序列中选择碱基序列如SEQ ID NO：1所示序列为保守序列。之后利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列如下：

正向引物的碱基序列为：gagttactga accaacagct(SEQ ID NO：2)；