[发明专利]耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒。

背景技术

随着抗生素的普遍应用，细菌耐药问题也日渐严重，随着2010年8月TheLancet Infectious Diseases杂志发表了一篇由印度、英国、瑞典、巴基斯坦和澳大利亚科学家联合研究报告，报道了抗生素抗性的一种新机制及其在印度、英国和巴基斯坦的播散情况，耐药性问题再一次惊醒世人抗生素滥用会终结我们依赖抗生素与细菌感染斗争的威力。

早在青霉素尚未临床应用的1940年，科学家就分离出了水解青霉素的酶，当时称为青霉素酶，在解析了青霉素为一种β-内酰胺结构的抗生素后，此酶也就重新命名为β-内酰胺酶。该酶按照功能和分子结构进行分类。根据功能特征分成群1～4，其中群2又分成亚群2a～2e、2f，2b进一步分成2be和2br两个亚群。根据该酶的核酸与蛋白序列进行分子分型，分为A～D 4个类型，分子型A、C和D是以丝氨酸为基础的作用机制，而B型或金属-β-内酰胺酶以锌指结构为基础的作用机制。群1是头孢菌素酶，分子型C，不被棒酸抑制；群2包括青霉素酶、头孢菌素酶或二者均有，均被棒酸抑制，属于分子型A和D，对应原始的TEM和巯基变异(sulfhydryl variable，SHV)基因；群3是金属酶，分子型B，不被棒酸抑制；群4是青霉素酶，没有分子型与之对应，不被棒酸抑制。新发现的NDM-1是金属蛋白酶，是一类新型具有广谱抗生素水解作用的β-内酰胺酶。

新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)基因介导的抗性是一种新报道的耐药新机制，NDM-1是一种新鉴定的对β-内酰胺抗生素具有广谱水解作用的一种酶，是编码碳青霉烯类酶(Carbapenamase)基因家族成员之一。NDM-1可以水解碳(杂)青霉烯类抗生素，以及头孢菌素和青霉素。携带该基因的细菌对几乎所有一线治疗重症感染的广谱抗生素都具有抗性，因此，被媒体称为“超级细菌”。该酶是质粒上bla_NDM-1基因编码的，容易通过基因水平转移在细菌间传播。该抗性细菌虽然发现时间不到1年，但其已经扩散到英国、美国、比利时、巴基斯坦等国家，并且从肺炎克雷伯菌扩散到大肠杆菌和鲍曼不动杆菌。由于从其他国家分离的携带NDM-1的耐药菌株，患者都有到印度就医的历史，因此，推测表达NDM-1菌株是从印度起源的。国际旅行和患者享受多国医疗服务可能会导致NDM-1的快速扩散，且可能导致潜在的严重后果。

鉴于我国目前还没有关于携带NDM-1菌株的报道，所以需要加强监测。因为我国目前对外交往频繁，尤其是在一些印度和巴基斯坦人聚集的地区，更应密切监测；对于往来印度和巴基斯坦的人员也要监测，尤其是在当地有住院或就医历史的人员更要密切监测。

最简便的检测方法就是基于核酸体外扩增的聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)，虽然NDM-1基因序列网上已经公布，在没有阳性对照模板的情况，会使得检测结果难以判定，而且，如果直接合成公布的基因，会造成合成基因对无抗性菌株的污染。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够保证生物安全的耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，所述耐药基因为NDM-1，所述序列含有SEQ ID NO：3所示的序列。所述序列可以含有SEQ ID NO：2所示的序列。

一种耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，所述耐药基因为NDM-1，NDM-1基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列，包括如下步骤：

a)对NDM-1基因序列进行点突变，获取突变基因，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：3所示的序列；

b)将所述突变基因合成并克隆入质粒；

c)将所述质粒线性化，得到所述阳性模板。

进一步的，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：2所示的序列。

进一步的，所述步骤a)中，插入一段多克隆位点。

进一步的，所述多克隆位点包括多个内切酶酶切位点，所述酶切位点选自：BamHI、EcoRI、HindIII。

进一步的，所述步骤c)中，将所述质粒线性化后，再将所述质粒去磷酸化。

一种由所述制备方法制备的阳性对照模板。

一种阳性对照模板在NDM-1检测上的应用。

一种耐药基因PCR检测试剂盒，包括所述的阳性对照模板。