[发明专利]柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：以柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物、下游外部引物进行对待测样品第一轮RT-PCR扩增，再以柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物、下游内部引物进行第二轮PCR扩增，最后电泳鉴定；所述柑桔碎叶病毒的特异性引物为：

上游外部引物：5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’

下游外部引物：5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’

上游内部引物：5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’

下游内部引物：5’- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’。

2.根据权利要求1所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取适量CTLV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核酸或RNA；

（2）第一步RT-PCR反应，所用特异性引物为：上游外部引物5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’、下游外部引物5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’；反应体系总体积10μL，包括：2×PCR 缓冲液 5μL，10μmol/μL上下游引物各0.5μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.3μL，5 U/μL RT/Taq酶0.2μL，模板核酸 1μL，超纯水2.5μL；

RT-PCR扩增条件为：42℃30 min；94℃2 min；94℃20s，54.5℃20 s，72℃ 45s，40个循环；72℃10 min;

（3）第二步PCR反应，所用特异性引物为：上游内部引物5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、下游内部引物5’-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3’；第二步扩增以第一步PCR产物混合液作为模板进行，反应体系为：10×PCR 缓冲液 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.8 μL，10μmol/μL引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，超纯水17.6μL，第一轮RT-PCR的反应混合液1μL；

 PCR扩增条件为：94℃，2 min；94℃，20 s，56℃，20 s，72℃，45s，40个循环；72℃10 min；

（4）琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；

（5）依据上述图谱的条带特征诊断CTLV的分子变异类型。

3.根据权利要求2所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：步骤（1）的提取方法为：称取5㎎病毒寄主皮或叶装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液，混匀，所述酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1；70℃水浴5~10分钟；室温下13000rpm离心5 分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4 分钟，收集洗脱液。

4.根据权利要求2所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：所述柑桔碎叶病毒特异性引物巢式扩增产物大小为256bp。

5.一种检测柑桔碎叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：由以下试剂构成：缓冲液A、RT/Taq酶、Taq酶、CTLV正对照、缓冲液B和双蒸水；其中，缓冲液A由10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’、10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引物5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’、2×PCR 缓冲液、50 mmol/L MgSO₄和超纯水组成；冲液B含10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5’- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’、10×PCR 缓冲液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO₄ 和超纯水。

6.根据权利要求5所述检测柑桔碎叶病毒的检测试剂盒，其特征在于：单样用量的缓冲液A含10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’ 0.5μL，10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引物5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’ 0.5μL，2×PCR 缓冲液 5μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.3μL、超纯水1.5μL；单样用量的缓冲液B含10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’ 1 μL、10μmol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5’- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’ 1 μL、10×PCR 缓冲液 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.8 μL，超纯水17.6μL。