[发明专利]柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于一种RT-PCR检测方法及其检测用试剂盒，具体的说，涉及一种柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

柑桔碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus, CTLV）是威胁柑桔生产的重要病原之一。CTLV在我国浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区曾造成比较严重的危害。应用和推广无病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前，柑桔无病毒苗木三级繁育体系已在我国多个柑桔产区建立，无病毒苗木得到了大面积的推广。为保证种苗安全，必须对采穗母本树进行定期鉴定，并对感染病毒的良种进行脱毒处理。这必然要求快速、灵敏的病毒检测技术。

CTLV是发状病毒属（Capillovirus）正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为600～700nm×15nm，基因组全长约6496 nt，5'端具帽子结构，3'端具Poly（A）尾巴。应用腊斯克枳橙等指示植物鉴定是CTLV检测的常规手段之一，但其检测周期较长（1－2年）并易受环境条件影响。血清学检测技术大大提高了CTLV的检测速度，在美国、日本等国得到广泛应用。Kawai等还制备了CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备不易，检测灵敏度有待提高。随着分子生物学的发展，RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。Magome等 ,Osvaldo等，Kirby等分别建立了RT-PCR检测体系，成功扩增出了CTLV特异性片段。Hailstones等建立了CTLV的半巢式RT-PCR检测方法，比Kawai 等酶联免疫法的灵敏度提高500倍以上。已有的报道表明，巢式PCR往往比普通PCR 具有更高的灵敏度，但关于CTLV的巢式RT-PCR检测方法尚无报道。我国可能是CTLV的起源地，因而不同地域或品种的分离物可能存在较大变异。在对我国CTLV的实际检测中，上述方法在检测灵敏度、检测范围上可能具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种柑桔碎叶病毒的特异性强、灵敏度高的巢式RT-PCR检测方法，本发明还提供了一种用于检测柑桔碎叶病毒的试剂盒，适合大规模、高通量样品检测。

本发明目的是这样实现的：本发明从自行设计的和已报道的检测柑桔碎叶病毒的引物中筛选出两对特异性引物用于柑桔碎叶病毒的巢式RT-PCR检测，其碱基序列为：

上游外部引物：5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’

下游外部引物：5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’

上游内部引物：5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’

下游内部引物：5’- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’。

本发明的目的可通过如下步骤来实现：

（1）取适量CTLV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核酸或RNA；

（2）第一步RT-PCR反应，所用特异性引物为：上游外部引物5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’、下游外部引物5’-AGAGTGGACAAACTCTA-3’；反应体系总体积10μL，包括：2×PCR 缓冲液 5μL，10μmol/μL上下游引物各0.5μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.3μL，5 U/μL RT/Taq酶0.2μL，模板核酸 1μL，超纯水2.5μL；RT-PCR扩增条件为：42℃30 min；94℃2 min；94℃20s，54.5℃20 s，72℃ 45s，40个循环；72℃10 min;

（3）第二步PCR反应，所用特异性引物为：上游内部引物5’-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、下游内部引物5’-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3’；第二步扩增以第一步PCR产物混合液作为模板进行，反应体系为：10×PCR 缓冲液 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，50 mmol/L MgSO₄ 0.8 μL，10μmol/μL引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，超纯水17.6μL，第一轮RT-PCR的反应混合液1μL； PCR扩增条件为：94℃，2 min；94℃，20 s，56℃，20 s，72℃，45s，40个循环；72℃10 min。

（4）琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；