[发明专利]一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提取微生物DNA的试剂盒，还涉及一种提取微生物DNA的方法。

背景技术

微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体。它们个体微小，结构简单，却与人类生活关系密切，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工业、农业、环保等诸多领域。

土壤微生物资源丰富，是陆地生态系统中重要的生命体，其对外界环境很敏感，抗逆性较差，很容易受到各种不良外界环境的影响。因此，土壤微生物是常用的土壤生态系统变化的预警及敏感指标。从土壤中获得微生物的传统方法是富集、培养、再分离，但是由于自然生态环境中的绝大部分微生物还无法在实验室被成功培养，因此相当多的菌种由于无法培养而不能被充分的开发和利用。同时，在此过程中也造成微生物多样性的丢失及种群构成发生变化，这样就使得对土壤微生物群落结构、功能以及动态监测的研究受到了极大的局限性和偏差。随着分子生物学和分子生态学技术的不断发展，不经过传统培养，直接从土壤中提取微生物DNA，通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、单链构象多态性(SSCP)或者是限制性片段长度多态性(RFLP)等分子生物学方法来研究土壤微生物的多样性及种群情况，已成为更能揭示土壤生态系统真实性的新途径。因此，从自然环境中提取微生物的基因组DNA，不仅能检测不能培养的细菌，还能跟踪某些目标菌株或重组基因，从而揭示土壤微生物生态系统中基因的多样性和监测土壤生态系统的变化。

但是，土壤成分复杂，通常含有较多的可与微生物DNA共同提取出来的物质，如腐殖酸、黄酸、酚类化合物、重金属离子等，这些物质可抑制PCR扩增中的Taq DNA聚合酶以及酶切反应中的限制性内切酶的活性，影响下游实验；同时，微生物仅为土壤样品中极小的一部分，微生物细胞常常紧密吸附于土壤颗粒表面，因此，从土壤样品中高效地获得微生物DNA具有相当的难度。另外，不同土壤样品之间差异较大，使得不同类型的土壤会影响土壤微生物DNA的提取效果，这对从环境样品中高效的提取DNA来说就更为困难。

目前从土壤中提取微生物DNA的方法可分为直接法和间接法两类。直接法采用原位裂解土壤微生物的方法，这种方法获得的基因组DNA都是粗提液，含有较多的杂质如腐殖酸、黄酸等，会抑制下游实验，必需再经过纯化回收才能使用；而间接法则采用差速离心回收菌体，然后再裂解菌体提取基因组DNA，但是这种提取方法需要专门的仪器，而且操作步骤繁琐，耗时较多，也容易造成物种的丢失。针对土壤中微生物DNA提取的难点和特点，一些大型生物公司研发出了提取土壤中微生物DNA的商业试剂盒，如Mo Bio UltraClean Soil DNAKit(MoBio Laboratories，Inc.，Solana Beach，Calif.)，虽然这种商业试剂盒使用起来非常方便、快捷，但提取微生物DNA的效果并不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取微生物DNA的试剂盒，采用该试剂盒提取微生物DNA纯度高、通用性好、可靠性高、提取速度快。

本发明的另一个目的在于提供一种提取微生物DNA的方法，该方法提取的微生物DNA纯度高、通用性好、提取速度快，可直接用于下游实验。

为实现上述目的，本发明提供一种提取微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

裂解液I、裂解液II、抑制物去除液I，抑制物去除液II和结合液，所述裂解液I包含pH8.0 50-200mM的Tris-HCl、pH8.0 50-150mM的EDTA、0.5-3M的NaCl、0.5-2％的CTAB和0.5-2％的PVP，所述裂解液II为使用终浓度为0.5-2％的SDS，所述抑制物去除液I为100-300mM的乙酸钾、乙酸钠或乙酸铵，所述抑制物去除液II为50-200mM的硫酸铝、硫酸铵或硫酸铝铵，所述结合液包含3-6M的盐酸胍、pH7.5 10-50mM的Tris-HCl和5-50％的异丙醇。

本发明所述裂解液I、裂解液II既含有阳离子去污剂，又含有阴离子去污剂，能够针对广泛的微生物群落，彻底裂解样品，同时还含有去除多糖多酚效果的成分，能使核酸和多糖多酚分离；所述的抑制物去除液I和抑制物去除液II能够最大限度的去除腐殖酸、黄酸、蛋白质等杂质；结合液能够提高核酸和玻璃纤维素膜的结合能力。

优选地，所述裂解液I包含pH8.0 100mM的Tris-HCl、pH8.0100mM的EDTA、1.5M的NaCl、1％的CTAB和1％的PVP。