[发明专利]白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)及其制备与用途。

背景技术

Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是植物控制亚油酸合成的关键酶，利用相关植物的FAD2基因进行基因重组，所得到的转基因植物或者植物以外其它转基因生物将在脂质代谢、细胞识别、免疫反应、耐寒等诸多方面将有新的表现。例如：中国发明专利申请200580048074.1公开的编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法中涉及了植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列，涉及到在转基因植物中的用途。如：脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法；以及应用这些新的植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存，等内容。中国发明专利申请200810186867.5公开的双途径基因表达同步抑制获得高油酸低芥酸油菜的方法中介绍了利用改良的RNA干扰技术和基因工程手段，对油酸转化为其它脂肪酸的两条代谢途径①和②上的基因表达同时进行干扰沉默，最大限度阻止油酸转化为其它类型的脂肪酸，实现大幅度提高油酸含量和大幅度降低芥酸含量的方法。

在GenBank中已公布花生、芸薹、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

发明内容

本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的FAD2基因，以及这种基因的制备方法及用途。

本发明所述的白沙蒿FAD2基因序列为基因序列表中的SEQ 1。

本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

上游引物P1：

5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，

下游引物P2：

5’-TKCCAYCRYIKSATWATRWKG-3’；

P3为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P4为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P6为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

P7：5’-AGAGGATCCATGGGCGCTGGT-3’

P8：5’-GCGGAGCTCTCAGTCGTACTTGCTTC-3’

其中：R＝A or G；Y＝C or T；V＝A or C or G；K＝G or T；S＝C or G；W＝A or T。