[发明专利]体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

1)载体构建：构建包括HBV启动子、报告基因和HBV全基因组的重组表达载体；

2)将步骤1)构建的重组表达载体转染到小鼠体内，得到体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中的HBV启动子为四个基本启动子sp1、sp2、核心启动子(cp)、xp与HBV两个增强子(EnhI和EnhII)的所有可能的组合；所述报告基因为可活体成像的所有已知报告基因，如荧光素酶报告基因Fluc、GLuc；所述HBV全基因组为HBV 1.2倍、1.3倍、1.5倍、2.0倍基因组。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中的HBV全基因组位于报告基因的下游。

4.根据权利要求1或2或3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中用于构建重组表达载体的出发载体为真核表达载体pGL3、pQE或pCI-neo；以pGL3为出发载体，构建的携带HBV启动子、Fluc报告基因和HBV全基因组的重组表达载体为pGL3-CP-Fluc-HBV1.2，其序列如序列表中序列1所示。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)将重组表达载体转染小鼠前还包括对重组表达载体进行纯化的步骤。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中的小鼠为雄性BALB/c小鼠(H-2^d)或C57BL/6(H-2^b)；所述小鼠年龄为4-6周。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中的转染方法采用水动力转染法，具体方法为：取4-6周龄的雄性小鼠，称重，将10μg重组表达载体混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在五秒钟内通过尾静脉使其快速转染至小鼠肝脏。

8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的构建方法，其特征在于：将重组表达载体转染小鼠体后还包括对其进行鉴定的步骤，具体方法为：小鼠在转染后第1、4、7、14、28、49、和70d尾静脉取血，检测血清中ALT水平、HBsAg和HBVDNA的表达情况；活体荧光成像监测报告基因表达情况；对HBsAg检测阳性的小鼠在不同时间点收集肝脏组织检测HBcAg表达情况及肝脏病理变化，以确定小鼠模型是否构建成功；

所述模型鉴定包括如下指标：

(1)报告基因的活体荧光成像；

(2)HBV抗原HBsAg的定量检测；

(3)HBV抗原HBcAg的免疫组化检测；

(4)HBV DNA含量的实时定量PCR检测；

(5)血清谷丙转氨酶(ALT)的测定；

(6)肝脏病理变化-HE染色观察。

9.权利要求8所述方法确定的体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型在监测HBV特异性CTLs的杀伤性和非杀伤性功能中的应用。

10.用权利要求1-8任一项所述方法构建的体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型。