[发明专利]体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的动物模型及其构建方法，特别是涉及一种体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型及其构建方法与其在监测HBV特异性CTLs的杀伤性和非杀伤性功能中的应用。 

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的感染严重影响着人类的健康，它能够引起急、慢性病毒性肝炎。急性感染后，有5-10％的成年人发展为持续感染，最终可以导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前，全球约有3.5亿乙型肝炎病毒慢性感染者，尽管现有的疫苗能够有效的预防乙型肝炎病毒，但不能治疗已经感染的患者。 

已有的研究表明：机体针对病毒所产生的特异性细胞免疫应答可能是清除机体内病毒的重要因素。目前认为：机体内病毒特异性细胞毒T淋巴细胞清除乙肝病毒主要是通过两条途径实现：即胞毒途径和非溶胞途径。胞毒途径是指机体针对HBV编码产物所产生的特异性T淋巴细胞借助其分泌的穿孔素、颗粒酶、α肿瘤坏死因子及其表面表达的Fas配体等介质摧毁感染病毒的靶细胞。在这条途径中特异性T淋巴细胞在清除病毒的同时也将导致靶细胞的裂解。非溶胞途径是指机体针对HBV编码产物所产生的特异性T淋巴细胞通过分泌特定的细胞因子抑制HBV的复制继而达到清除病毒的作用。这条途径中特异性T淋巴细胞只是清除了靶细胞内的病毒，而对靶细胞本身并无损伤。在急性HBV感染的机体内这两条途径都存在。实验研究表明：在特异性T细胞清除病毒的过程中，非溶胞途径可能扮演着更重要的作用。 

病毒特异性CTL清除胞内病毒机制的研究不仅有助于更全面地认识特异性CD8⁺T细胞在抗病毒感染方面的重要作用，也有助于更深刻地理解HBV持续感染的免疫学机制，并为HBV慢性感染的治疗，如治疗性疫苗的研究，提供了理论基础和新的思路。目前，HBV特异性CTLs体内抗病毒功能的测定是主要通过以下几种间接方式进行的：(1)通过血清ALT水平反映肝细胞的损伤；(2)通过组织化学检测CTL的侵润；(3)通过血清中病毒蛋白或基因水平的减少反映CTL的杀伤活性。虽然它们是被广泛认可的测定抗病毒免疫的参数，但存在着低敏感度、有样本误差、且仅反映过去的免疫反应 效应等缺点。因此，建立一种体内实时监测HBV特异性CTLs的杀伤性和非杀伤性功能的方法势在必行。 

发明内容

本发明提供了一种可用于体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型的构建方法。 

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型的构建方法，可包括以下步骤： 

1)载体构建：构建包括HBV启动子、报告基因和HBV全基因组的重组表达载体； 

2)将步骤1)构建的重组表达载体转染到小鼠体内，得到体内监测HBV特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型。 

在上述小鼠模型的构建方法中，所述步骤1)中的HBV启动子为四个基本启动子sp1、sp2、核心启动子(cp)、xp与HBV两个增强子(EnhI和Enh II)的所有可能的组合；所述报告基因为荧光素酶报告基因Fluc、GLuc等可活体成像的所有已知报告基因；所述HBV全基因组为HBV 1.2倍、1.3倍、1.5倍、2.0倍基因组。 

所述步骤1)中的HBV全基因组位于报告基因的下游。 

所述步骤1)中用于构建重组表达载体的出发载体可为真核表达载体pGL3、pQE、或pCI-neo等，优选为pGL3。 

以pGL3为出发载体，构建的携带HBV启动子、Fluc报告基因和HBV全基因组的重组表达载体为pGL3-CP-Fluc-HBV1.2，其序列如序列表中序列1所示。 

上述表达载体均可按照常规方法构建。 

所述步骤2)将重组表达载体转染小鼠前还包括对重组表达载体进行纯化的步骤。 

所述步骤2)中的小鼠为雄性BALB/c小鼠(H-2^d)或C57BL/6(H-2^b)。 

所述步骤2)中的小鼠年龄为4-6周。 

所述步骤2)中的转染方法可采用水动力转染法，具体方法可为：取4-6周龄的雄性小鼠，称重，将10μg重组表达载体混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在五秒钟内通过尾静脉使其快速转染至小鼠肝脏。