[发明专利]一种从甲醛固定组织或甲醛固定石蜡包埋组织中提取总蛋白质的方法

权利要求书

1.一种从甲醛固定组织或甲醛固定石蜡包埋组织中提取总蛋白质的方法，包括以下步骤：

1)将甲醛固定的组织用不含有去污剂的蛋白质抽提试剂在两种不同的温度条件下温育以释放被交链的蛋白质；

或者，将甲醛固定石蜡包埋的组织先用脱蜡试剂去蜡后，再用不含有去污剂的蛋白质抽提试剂在两种不同的温度条件下温育以释放被交链的蛋白质；

2)离心并分离上清，上清加入蛋白质沉淀试剂后分离并洗涤沉淀，再将沉淀采用合适的溶解试剂溶解获得甲醛固定的组织或甲醛固定石蜡包埋的组织的总蛋白质提取液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醛固定的组织或甲醛固定石蜡包埋的组织均为组织切片。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述脱蜡试剂包括可以溶解石蜡的有机溶剂和与石蜡不相溶的有机溶剂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，将甲醛固定石蜡包埋的组织用脱蜡试剂去蜡的方法为：将石蜡包埋组织先用可以溶解石蜡的有机溶剂处理3-5分钟，而后再在前述处理液中加入与石蜡不相溶的有机溶剂处理5-60秒，再将处理后的组织洗涤并分离。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述可以溶解石蜡的有机溶剂与与石蜡不相溶的有机溶剂的体积比为5∶1-20∶1。

6.如权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的可以溶解石蜡的有机溶剂选自甲苯，二甲苯，D-柠檬烯，正戊烷，正己烷，正庚烷和正辛烷；所述的与石蜡不相溶的有机溶剂选自乙醇，甲醇，异丙醇和正丁醇。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述的不含有去污剂的蛋白质抽提试剂由还原试剂、变性试剂和缓冲液组成。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的还原试剂选自巯基乙醇，DTT和TCEP，在蛋白质抽提试剂中的浓度为5-500mM；所述的变性试剂选自尿素，硫尿，盐酸胍，异硫氰酸胍，高氯酸钠和碘化钠，在蛋白质抽提试剂中的浓度为1-9M；所述的缓冲液选自HEPES，MOPS，TRIS，PIPES，MES，Glycine NaOH和Citrate缓冲液体系，在蛋白质抽提试剂中的浓度为10-1000mM，缓冲体系的pH为2-10。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的还原试剂在蛋白质抽提试剂中的浓度为20-200mM；所述的变性试剂在蛋白质抽提试剂中的浓度为3-7M；所述的缓冲液为20-200mM pH 5-9的缓冲体系。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不含有去污剂的蛋白质抽提试剂含有如下组分：

pH3-9的20-200mM Tris-HCl；

TCEP 20-200mM；

异硫氰酸胍3-7M。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，在两种不同的温度条件下温育的方法为：先在30-120℃下温育10-60分钟；而后在30-100℃下温育1-5小时。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在两种不同的温度条件下温育的方法为：先在60-120℃下温育20-60分钟；而后在30-80℃下温育1-5小时。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述蛋白质沉淀试剂选自三氯乙酸，DOC，乙醇，丙酮，硫酸氨，PEG8000，乙醚和二乙醚中的一种或多种的混合。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀试剂为二乙醚与乙醇的混合物，二乙醚与乙醇的体积比为1/3-4/1；或者所述蛋白质沉淀试剂为乙醚与乙醇的混合物，乙醚与乙醇的体积比为1/2-2/1。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的合适的溶解试剂选自laemmli sample buffer、IEF sample buffer、2D sample buffer或基质缓冲液。