[发明专利]一种从甲醛固定组织或甲醛固定石蜡包埋组织中提取总蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物技术领域，尤其是临床蛋白质组学领域，是一种从甲醛固定的，或甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织中快速高效提取总蛋白质的方法。

背景技术

医院病理挡案中保存了大量的甲醛固定的，或甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织切片样本，这些样本绝大多数已经保存了几十年，甚至上百年，石蜡包埋组织是病理分子生物学和蛋白质组学研究的重要材料。由于体外培养的细胞的表达谱研究并不能够真实反映体内细胞的真实状况，研究其正常细胞和疾病相关的细胞，特别是癌细胞中表达谱差异，对于判断癌化的进展，癌症的类型的判定，以方便于诊断和治疗有重要的意义，因此从甲醛固定的，或甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织切片样本中提取DNA，mRNA，MicroRNA，SnoRNA，全蛋白等等加以研究是一个重要的基础性工作，而合适的提取试剂和提取方法是关系到所提取的核酸或蛋白质样品能否反映FFPE切片样本中真实数量和方便，快捷，安全地进行下游的重要环节。早先人们主要从从甲醛固定的，或甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织切片样本提取的是DNA(Goelz 1985，Dubeau 1986)，而后Erlander(2003)等从FFPE组织切片样本中提取RNA和mRNA用于表达谱研究。

可是对于FFPE组织切片样本的表达谱研究研究的重要方面-全蛋白的提取，由于蛋白质被甲醛固定，所以蛋白质分子内部以及蛋白质分子之间存在着交链，导致蛋白质分子的可溶性较差和蛋白质的抗原表位，特别是蛋白质立体表位被严重破坏，用常规的试剂对脱蜡后的石蜡包埋组织内的蛋白质抽提时，全长的蛋白质会严重断裂为多肽和抗原表位的恢复程度较差，所以国内外对石蜡包埋组织内全长蛋白质的提取报道较少。Ikeda(1998)使用有机溶剂对含有2％SDS的RIPA裂解液，通过加热，提取淀粉样蛋白质，可是Shan-Rong Shi(2006)在使用Ikeda的方法，用同样的裂解液对同样类型的新鲜组织样本对全蛋白质提取时，通过比较新鲜和石蜡包埋组织切片的SDS-PAGE的图谱发现，部分含量较少的蛋白在石蜡包埋组织的western blot检测信号较弱甚至无法检测到，并且50-10Kda区域，蛋白质条带呈现出涂抹状，说明蛋白质的提取效率较低，全长的蛋白质严重断裂。Okaka(2005)使用高温脱腊，再通过温育含有尿素，2％SDS和巯基乙醇的溶液提取蛋白，但是石蜡不能够被完全去除干净，提取的蛋白也被尿素在高温下修饰，同时高浓度的SDS对下游操作，特别是蛋白的MS(质谱分析)产生严重的影响。Shan-Rong Shi(2006)使用了一种含有20mMTris-HCl，pH 9.0，2％SDS的溶液对脱腊的组织切片蛋白质高温提取时，蛋白质的产量有所提高，但是SDS不容易去除，会对抗原表位的恢复和MS分析产生严重的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种从甲醛固定的，或甲醛固定石蜡包埋(Formalin-Fixed，Paraffin-Embeded Tissue FFPE)的组织中快速高效提取全蛋白质的方法。

本发明的基本程序包括以下步骤：

1)将甲醛固定的组织用不含有去污剂的蛋白质抽提试剂在两种不同的温度条件下温育以释放被交链的蛋白质；

或者，将甲醛固定石蜡包埋的组织先用脱蜡试剂去蜡后，再用不含有去污剂的蛋白质抽提试剂在两种不同的温度条件下温育以释放被交链的蛋白质；

2)离心并分离上清，上清加入蛋白质沉淀试剂后分离并洗涤沉淀，再将沉淀采用合适的试剂溶解获得甲醛固定的组织或甲醛固定石蜡包埋的组织的全蛋白质提取液。

较佳的，所述甲醛固定的组织或甲醛固定石蜡包埋的组织均为组织切片。

步骤1中，所述脱蜡试剂包括可以溶解石蜡的有机溶剂和与石蜡不相溶的有机溶剂。

所述的可以溶解石蜡的有机溶剂可以选自甲苯，二甲苯，D-柠檬烯，正戊烷，正己烷，正庚烷和正辛烷等无极性有机溶剂。

所述的与石蜡不相溶的有机溶剂可以选自乙醇，甲醇，异丙醇和正丁醇等弱极性有机溶剂。

所述将甲醛固定石蜡包埋的组织用脱蜡试剂去蜡的方法具体为：将石蜡包埋组织先用可以溶解石蜡的有机溶剂处理3-5分钟，而后再在前述处理液中加入与石蜡不相溶的有机溶剂处理5-60秒，再将处理后的组织洗涤并分离。

所述可以溶解石蜡的有机溶剂与与石蜡不相溶的有机溶剂的体积比为5∶1-20∶1，优选5∶1-10∶1。