[发明专利]一种用于转基因大豆检测的五基因标准质粒分子及其构建

权利要求书

1.一种转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征在于，通过特异性PCR引物从转基因大豆基因组DNA中扩增出大豆内源基因Lectin 1、筛选序列35S和NOS、外源基因PAT和EPSPS基因，利用融合PCR将这五个基因融合成一个片段，并构建到质粒载体pMDTM19-T Simple中，获得标准质粒分子pTLE5。

2.权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征是，含有大豆内源基因特异性序列Lectin 1、筛选序列35S和NOS、转基因大豆品系A2704-12转化事件PAT基因特异性序列和转基因大豆品系GTS40-3-2转化事件EPSPS基因特异性序列，其先后顺序为Lectin1+35S+NOS+PAT+EPSPS。

3.根据权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其中Lectin1+35S+NOS+PAT+EPSPS标准分子的引物序列如下：

4.一种如权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用生物学数据库进行生物信息学分析，获得大豆内源基因Lectin 1、转基因大豆筛选序列35S和NOS、转基因大豆品系A2704-12外源基因PAT和转基因大豆品系GTS40-3-2外源基因EPSPS的特异性序列；

(2)设计PCR特异性引物；

(3)Lectin 1+35S+NOS+PAT+EPSPS基因的融合PCR：

第一轮反应：以转基因大豆品系GTS40-3-2、转基因大豆品系A2704-12基因组DNA为模板，以权利要求3中对应引物进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍Taq缓冲液5μl，dNTPs(10mM)4μl，上下游引物(10μM)各4μl，模板(10ng/μl)1μl，用ddH2O补足至50μl。

反应程序为：95℃5min；30个循环(94℃30sec，56.8～59.5℃30sec，72℃30～60sec)；72℃10min；4℃保存；产物标记为PLec1、P35S、PNOS、PPAT、PEPS；

第二轮反应，分两步进行扩增：

第一步：取第一轮反应产物各70ng，10倍Taq缓冲液5μl，dNTPs(10mM)4μl，用ddH2O补足至50μl；其中PLec1与P35S相连接，PNOS与PPAT相连接；

反应程序：15个循环(94℃20sec，58.8～60℃85sec)，4℃保存；

第二步：向第一步反应液中分别加入引物Lec-P1和35S-P2各1μl，引物Nos-P1和PAT-P2各1μl；

反应程序：：94℃3min，28个循环(94℃15sec，60℃1min，72℃2min)，4℃保存；将融合PCR产物割胶纯化后标记为PLec1-35S、PNOS-PAT。

第三轮反应：将产物PLec1-35S、PNOS-PAT和PEPS进行融合PCR反应。

取第一轮反应产物PEPS与第二轮中的产物PLec1-35S、PNOS-PAT各2μl作为模板，引物为Lec-P1和Eps-P2扩增；反应体系为：总体积50μl，其中10倍Taq缓冲液5μl，dNTPs(10mM)4μl，上下游引物(10μM)各1μl，用ddH2O补足至50μl；

反应程序：94℃30sec，28个循环(94℃15sec，60℃1min，72℃2min)，4℃保存；将PLec1-35S、PNOS-PAT和PEPS连接产物标记为PLE5。

(4)回收纯化PLE5，连接于pMDTM19-T Simple载体，获得标准质粒分子pTLE5。