[发明专利]一种用于转基因大豆检测的五基因标准质粒分子及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法。 

背景技术

自1996年以来，全球转基因作物种植面积以年均10％以上的速率增长，2009年全球批准种植的转基因作物达1.34亿公顷，其中转基因大豆种植面积达到6900万公顷，占大豆总种植面积的77％。随着转基因作物的广泛种植，其安全性问题引起了全球公众的普遍重视。欧盟于1998年在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。随之，日本、澳大利亚、韩国等国家对转基因成分的最低含量做了不同的规定，阈值从1-5％不等。我国于2001年5月23日发布了《农业转基因生物安全管理条例》，2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。 

标识制度的实施依赖于转基因产品检测技术。目前主要有两类技术：一类是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一类是基于蛋白质方法，如ELISA、试纸条等，其中PCR方法应用最广。针对插入的外源DNA序列，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测。通用元件筛选PCR检测主要是以转基因通用元件CaMV35S启动子和NOS终止子为目的基因片段；基因特异性PCR检测是以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段；品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，所以品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并逐步地为国际各检测实验室所采用。 

在进行PCR检测时，需要设置阳性对照以确保检测过程的有效性和检测结果的可靠性，特别是在定量PCR检测中需要用含量准确的转基因作物阳性标准品(CRMs)来制作标准曲线。然而，由于转基因作物存在生物安全性和和现有技术的限制，转基因作物阳性标准品很难获得，这种现状已成为检测方法和应用的瓶颈。因此亟需研制能够替代转基因作物标准物质的新型阳性对照材料，以满足不断发展的转基因检测需求。 

标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目 的外源基因和/或内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子，研究表明质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准物质替代物。近年来，国内外众多学者报道了一些用于转基因产品检测的标准质粒分子。标准质粒分子的容量也有一个大的提升，从最初的单一目标基因的质粒分子到多目标基因的质粒分子，这些质粒分子可同时涉及不同物种的转基因作物的多个基因。目前，利用融合PCR技术可以实现多个基因片段的拼接，这样利用一个标准质粒分子就可以实现对多个转基因作物的检测。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替阳性标准物质用于转基因大豆的定性和定量PCR检测。利用融合PCR技术的原理设计了大豆Lectin基因、35S启动子、NOS终止子、PAT基因、EPSPS基因的PCR融合引物，经过融合PCR扩增获得了五基因的融合大片段。利用分子克隆技术将融合大片段插入到pMD^TM 19-T Simple载体中，获得了重组质粒分子pTLE5。本发明构建的标准质粒分子pTLE5可以作为检测过程中的阳性对照，为解决转基因作物检测中标准物质缺乏的难题提供一条有效途径并能有效地保障检测工作的进行。 

本发明所述标准质粒分子含有大豆内参基因Lectin、35S启动子、NOS终止子、PAT基因、EPSPS基因的一段序列，可以替代转基因大豆品系GTS40-3-2和转PAT基因大豆，用于定性和定量PCR检测。 

本发明所述的一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，包括以下步骤：

(1)利用GenBank数据库查找并获得大豆内参基因Lectin、35S启动子、NOS终止子、EPSPS基因、PAT基因； 

(2)利用Primer Premier 5.0软件设计PCR特异性引物并进行blast验证； 

(3)分别扩增上述五个基因； 

(4)采用融合PCR方法将五个基因拼接成大片段；