[发明专利]一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于非洲猪瘟病毒核酸扩增和检测的PCR引物对和特异性核酸探针，其特征在于，所述的PCR引物对和特异性核酸探针选自下列各组：

（a）正向引物：5'-CGTATCTGGACATAAGACGT-3'，

反向引物：5'-ATGCGTCTGGAAGAGCTGT-3'；

生物素标记的捕捉探针：5'-生物素-TTTTTTTTTTGCGCAAGAGGGGGCTGATAG-3'；

巯烷基标记的检测探针：5'-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCTTTTTTTTTT-O-(CH₂)₃-SH-3'；

（b）正向引物：5’-ATAAGCTTTCAGGATAGAG-3’，

反向引物：5’-CATAATCCGTGTCCCAACT-3’，

生物素标记的捕捉探针：5’-生物素-TTTTTTTTTTAGGGTATGTAAGAGCTGCAG-3’；

巯烷基标记的检测探针：5’-ATACCATGAGCAGTTACGGTTTTTTTTTT-O-(CH₂)₃-SH-3’；

（c）正向引物：5’-CACGCAGAAATAAGCTTTC-3’，

反向引物：5’-CGTGTCCCAACTAATATAA -3’，

生物素标记的捕捉探针：5’-生物素- TTTTTTTTTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTC-3’；

巯烷基标记的检测探针：5’ -CGTCTGGAAGAGCTGTATCTTTTTTTTTT-O-(CH₂)₃-SH-3’。

2.权利要求1的PCR引物对和特异性核酸探针在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（a）利用PCR引物扩增待测样本中核酸；

（b）将烷巯基标记的检测探针标记至纳米金颗粒上；

（c）将生物素标记的捕捉探针和步骤（b）纳米金标记的检测探针与变性的PCR产物杂交；

（d）将步骤（c）的杂交体系加入包被链亲素的酶标板，捕捉杂交复合物；

（e）银染增强捕捉的纳米金；

（f）终止银染增强反应，肉眼观察灰度判定结果。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：（b）步骤中对烷巯基修饰的检测探针进行纳米金标记，标记的纳米金颗粒大小30-80nm。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：（c）步骤中，将步骤（a）扩增的PCR产物94℃变性5min后快速冷却，加入生物素标记捕捉探针和纳米金标记的检测探针，混匀。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：（d）步骤中的链亲素吸附的酶标板在制备时，将链亲素用pH 7.4、0.01mol/L PBS稀释成20ug/mL，4℃过夜包被高吸附性酶标板，再将（c）步骤中的杂交反应体系加入其中，42℃进行杂交30min。

7.包含权利要求1所述PCR引物对和特异性核酸探针的非洲猪瘟病毒检测试剂盒。