[发明专利]一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性传染病，其特征是发病过程短，死亡率高达100%，该病国际兽疫局（OIE）将其归入A类疾病，我国将其划入1类疾病，由于我国目前无非洲猪瘟病发生，因此无法在发病猪体内进行直接检测。

1.国内外现有的非洲猪瘟（ASF）检测技术

① 血吸附（HAD）试验：是ASF最经典的检疫方法之一，该方法敏感性较高，缺点是费时、操作繁琐且技术要求高，需制备、培养骨髓细胞，且不能用于非血吸附毒株的诊断。

② 血清学检测技术：由于感染康复猪血清中的非洲猪瘟病毒（ASFV）特异抗体能维持很长时间甚至终生，可用ELISA等常规免疫学方法检测。Wardley等（1979）建立的ELISA方法能检测到50-500HAD₅₀/ml的ASFV；Vidal等（1997）用p72特异单抗建立了检测ASFV的夹心ELISA；蒋正军等（2000）用杆状病毒表达的重组p72抗原建立了检测ASFV特异抗体的间接ELISA。尽管ELISA具有一定的特异性和敏感性，但主要用于感染康复和慢性感染猪血清中ASFV抗体的检测，不适合急性感染和临床前检测，而且操作较复杂，反应时间较长，有时出现假阴性，目前已不是ASF诊断的首选。

③ PCR检测技术：根据ASFV高度保守基因序列设计PCR引物，理论上可以扩增出包括非血吸附和低毒力分离株在内的所有ASFV病毒核酸。Steiger等（1992）首先根据ASFV DNA保守区序列设计2对PCR引物，用建立的PCR检测细胞培养和感染组织中的ASFV，具有灵敏、快速优点，但检测血液样品时易出现非特异条带；孙书华等（1995）在国内率先建立了ASFV p72基因的PCR扩增方法，但未进行病毒感染细胞和临床样品的检测；蒋正军等（2000）根据ASFV p72基因序列设计两对引物，用建立的PCR对4个毒株感染细胞培养、感染猪组织和200份临床样本进行检测，结果显示与HAD试验的阳性符合率为100%；Gonzague等（2002）和Aguero等（2003）建立了可用于临床样本中ASFV快速诊断的PCR方法；King等（2003）建立了检测ASFV的TaqManPCR技术；Zsak等（2005）建立了用于接触ASFV猪临床前诊断的实时定量PCR技术。PCR检测技术的特出优点是快速和敏感性高，还适合因腐败等原因不能进行病毒分离或抗原检测样品的检测，适合动物及其产品的进出口检疫，已成为ASF检疫技术的主要发展方向之一，但有时存在假阳（阴）性问题，需用其它检测方法予以证实。

然而，上述ASFV检测方法通常仅限于在ASF疫区国家和少数非疫区国家的专门实验室使用，而国内建立的ASFV诊断方法的敏感性、特异性和实用性尚需临床实践验证，目前我国动物检疫部门还缺少敏感、特异、使用方便、价格经济的ASFV检测方法。随着我国周边地区ASF的发生（如格鲁吉亚），以及各种国际交往，特别是与非洲、拉美国家交往的增多，ASF对我国的潜在威胁越来越大，因此研制快速、特异、敏感、廉价的ASFV检疫技术已迫在眉睫。

2. 核酸扩增纳米金检测技术

核酸扩增纳米金检测技术是在DNA芯片基础上发展起来的检测特定核苷酸序列新技术，纳米金是直径为1-100nm的金颗粒，分散在水中的水溶胶又称纳米金，具有巨大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性，作为免疫学试验标记物使用已又很长的历史。纳米金核酸扩增技术的基本原理是以烷巯基寡核苷酸修饰的纳米金颗粒为报告基团，将探针与靶序列杂交，通过捕捉探针也可与同一条靶序列杂交，将形成的复合物捕捉、固定于酶标板中，通过银染色可将敏感性提高10⁵倍，能检测浓度为10fM的靶片段，直接用肉眼观察酶标板孔中颜色变化即可作出判断，为非洲猪瘟病毒提供了一种简便、快速、廉价的检测方法。目前国内外尚无核酸扩增纳米金检测非洲猪瘟病毒感染方面的报道。

发明内容

本发明的目的是要克服非洲猪瘟病毒现有检测技术的不足之处，提供一种非洲猪瘟病毒核酸扩增的引物、检测用的探针，以及应用上述引物和探针检测非洲猪瘟病毒的方法。

本发明所说的用于非洲猪瘟病毒核酸扩增和检测的PCR引物对和特异性核酸探针，选自下列各组：

（a）正向引物：5'-CGTATCTGGACATAAGACGT-3'，（SEQ ID NO：1）