[发明专利]计数并鉴别微生物的方法

说明书

本发明涉及一种计数并鉴别微生物的方法。更具体地，本发明涉及一种扩增该微生物的特异成分，然后根据对所扩增的成分产物的测定，在具有很少或无孵育时间的单一步骤中计数膜装置上的微生物的方法。另外，用这个方法可以鉴别所述微生物。

背景技术

确定液体例如水、食品例如汁、或药品中有无微生物存在的常规方法是将液体过滤通过合适的膜以将液体中所存在的任何微生物都阻挡于膜的表面上。然后将膜放置于加有琼脂或其他合适培养基的生长培养皿例如陪替培养皿中，然后孵育数天以容许被捕获的微生物发展成菌落。

然后取出培养皿肉眼观察，使得可以计数所存在的菌落数目。如果数目足够多，可以进行进一步的测定以准确地确定出存在的是什么生物体。(仅仅存在微生物这一情况本身经常并不说明液体是不安全，且需要进一步的工作来鉴别特殊微生物)。

根据生物体的种类、所规定的它们的孵育时间和生长速度、以及需要进行的附加鉴别试验、以及在工作日期间所取样的时间和在下一个有用的工作日预备好方法的时间，该方法通常需要花费2到14天或更长时间。

最近，用于检测和计数微生物污染的新方法已经帮助将进行测定所需的时间减少到约24个小时甚至更短的时间。例如，ATP生物发光法是产生光能产物的生物化学反应；用该方法，已经能够以在培养基观察检测法中所需生长时间的1/3时间内检测并计数微生物。其他技术利用荧光分子或其他染料从膜上的各种样品中快速地检测微生物。也已经用探针杂交技术在比菌落生长更短的时间内检测并计数膜上的微生物；在这些技术中，将已经在膜上短时间生长的微生物与核酸探针杂交并用检测试剂处理以检测膜表面上所存在的任何微菌落。

US 2003-0003540-A1发展了ATP测定。它将微生物捕获于膜上并在培养基中孵育微生物数小时到1天。首先进行计数测定(通常用生物发光ATP检测法)，然后在第二个测定中将PNA探针用于同一样品以鉴别所发现的微生物。

然而这些测定方法中没有一种能够以与经典的多日观察测定方法相同的准确性和特异性实时(在数小时内)检测、计数和鉴别微生物。本发明提供了在数小时内检测并计数膜表面上的微生物的单一测定方法，并且也可容许在同一过程中进行鉴别。

发明内容

本发明涉及一种利用膜过滤、靶向扩增和检测例如荧光检测或比色检测来检测、计数及鉴别液体中的微生物的方法。本方法关键的特点是采用该扩增步骤可以进行快速检测、计数并鉴别所存在的生物体。扩增针对的是生物体中的一种选定分子例如其DNA或RNA，并将该分子的量增加到能被多种现有的检测技术所检测到的水平，以便确定所存在的靶分子。扩增试剂包括一或多种检测剂，所述检测剂用于表明靶分子存在并能区分出所选定的靶在种或属或甚至门、界水平上的区别。

本发明的一个目的是提供一种计数并鉴别微生物的方法，其包括：

a)将液体样品过滤通过适用于截留微生物的膜；

b)用一或多种含有一或多种检测剂的试剂对膜上的微生物进行扩增步骤；以及

c)在存在所选定的检测剂的情况下，确定出是否存在一或多种所截留的微生物，计数所检测到的数目并鉴别该微生物的类型。

附图说明

图1显示了本发明的一种优选实施方案的示意图。

图2显示了本发明的第二个优选实施方案的示意图。

具体实施方案

本发明涉及一种快速检测、计数并鉴别液体或可溶性固体例如粉末、盐、乳膏、片剂等中的微生物的方法。这些液体包括但不限定于水、饮料或奶制品例如牛奶、啤酒、酒、软饮料、果汁、药物、肠外营养、细菌空气计数(bacterial air counts)等。

现有的快速技术可以在比在琼脂或滤膜上生长可见菌落的经典方法远远更短的时间内检测并计数微生物。然而那些检测到的生物体仍是未被鉴别的。本方法满足了对快速检测和计数系统的需要，并可以用种或属分型特异探针、或更高的门或纲水平的特异探针，在扩增反应中对所检测到的微生物进行鉴别。