[发明专利]肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗，其特征在于该疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白GFP报告基因替代肿大细胞病毒vsocs基因，构建并分离、纯化获得重组vsocs基因缺失病毒，将其作为肿大细胞病毒减毒活疫苗，该减毒活疫苗通过水体浸泡感染而使宿主鱼体产生免疫。

2.权利要求1所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

（1）重组vsocs基因缺失病毒转移载体的构建：通过PCR扩增vsocs基因在ISKNV基因组上下游各约1000bp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真核表达载体pEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载体的vsocs基因上下游片段之间，该克隆载体为vsocs基因缺失病毒转移载体；

（2）重组vsocs基因缺失病毒的同源重组：鳜鱼仔鱼细胞先通过瞬时转染vsocs基因缺失病毒转移载体5h后，再感染病毒1h，根据病毒复制的同源重组原理，72-96h预期获得GFP基因替代vsocs基因的重组vsocs基因缺失病毒；

（3）重组vsocs基因缺失病毒的分离和纯化：通过荧光显微镜观察并挑取发生病变且表达GFP蛋白的细胞，通过有限稀释法获得单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒；

（4）肿大细胞病毒基因缺失减毒活疫苗的制备：上述单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒，通过感染MFF-1细胞，扩大培养；将病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，经0.22μm滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80℃冰箱中，即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品；

（5）水体浸泡感染体系：以不同稀释度的重组vsocs基因缺失病毒，通过水体浸泡感染鳜鱼2~4 h，记录感染鳜3周内的发病情况和死亡率，评定重组vsocs基因缺失病毒作为肿大细胞病毒的基因工程活疫苗的可行性，将暂养3周的重组vsocs基因缺失病毒感染鳜再次进行攻毒实验，记录感染鳜4周内的存活率和保护率。

3.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述vsocs基因作为肿大细胞病毒减毒活疫苗的基因缺失对象。

4.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中，通过PCR扩增vsocs基因上下游约1000bp的片段作为重组转移载体的组成部分。

5.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中，先瞬时vsocs基因缺失病毒转移载体4~6h后，再感染病毒。

6.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中，利用GFP基因替代vsocs基因的重组vsocs基因缺失病毒。

7.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中，通过有限稀释法获得单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒。

8.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中，单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒，稀释于PBS溶液中即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品。

9.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中，水体浸泡重组vsocs基因缺失病毒感染鳜鱼2~4 h，作为疫苗免疫途径和免疫时间。

10.权利要求1所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗在预防鱼类肿大细胞病毒感染中的应用。