[发明专利]肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

我国是世界海水养殖产业大国，养殖规模和产量居世界第一。但是，随着养殖品种的增多和养殖规模的扩大，各种养殖品种每年发病率均在50%以上，而死亡率高达20%以上，直接造成的经济损失每年超过百亿元人民币。病害已经成为水产养殖可持续发展的主要障碍。

肿大细胞病毒是新近出现的对鱼类具有重大危害作用的恶性传染病的病原，分子流行病学研究发现，有50多种的海水鱼类和近10种的淡水鱼类是这种病毒的携带者。肿大细胞病毒对世界各国，特别是东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区的水产养殖业构成巨大威胁，每年都能造成重大经济损失。目前，肿大细胞病毒的主要毒株有流行于于中国大陆的鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、斜带石斑鱼虹彩病毒（OSGIV）、大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、斑石鲷虹彩病毒（SKIV）；流行于日本的真鲷虹彩病毒（RSIV）、石斑鱼昏睡病虹彩病毒(GSDIV)、非洲灯笼鱼虹彩病毒（ALIV）和闪电丽鱼虹彩病毒（DGIV）；流行于韩国的条石鲷虹彩病毒（RBIV）、牙鲆虹彩病毒（FLIV）、大菱鲆虹彩病毒(TBIV)；流行于中国台湾的真鲷虹彩病毒和台湾石斑鱼虹彩病毒(TGIV)；出现在新加坡的鲻鱼和虎斑虹彩病毒及流行于澳大利亚的巨鳕银鲈虹彩病毒(MCIV)和丽丽鱼虹彩病毒(DGIV)等。肿大细胞病毒的宿主覆盖了众多具有重大经济价值的养殖鱼类，对肿大细胞病毒所引发的系列鱼病的控制成为有关国家的共识。

开展免疫防治是控制肿大细胞病毒流行和危害的有效手段。国际上，日本借助RSIV的高敏感细胞系GF（石鲈鳍条细胞系）研制的RSIV全细胞灭活疫苗成功实现了商业化生产，已经比较广泛地应用于真鲷等海水养殖鱼类。RSIV灭活苗也曾经出口到我国广东及海南等沿海养殖区，在一些名贵海水养殖鱼类（石斑鱼，真鲷）中有所应用，总体效果不错。但由于价格偏贵（注射免疫，约1元/尾），注射免疫耗时耗力等不利因素的影响，日本进口的RSIV灭活苗在我国的应用比较有限。此外，由于灭活疫苗存在免疫期短、保护力低、用量大以及通常需要加入佐剂，并缺乏自然感染的局部免疫保护的因素限制了该类疫苗的发展。因此，开发新型的渔用基因工程疫苗成为当前水产病害控制的首要问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种肿大细胞病毒基因缺失活疫苗，该疫苗可以通过水体浸泡的方法用于鱼类肿大细胞病毒的预防，大大降低水产业病毒性疾病的发病率和操作成本。

本发明的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗的制备方法，该制备方法简单，成本低，有利于大规模推广应用。

本发明的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗在鱼类肿大细胞病毒预防中的应用。

本发明的上述目的通过以下方案予以实现：

一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗，该疫苗是通过在鱼类细胞中通过基因工程技术将外源GFP基因替代肿大细胞病毒的vsocs基因而得到的重组vsocs基因缺失病毒，收获病毒液并稀释后得到的。

上述肿大细胞病毒减毒活疫苗的制备方法，其具体步骤如下：

（1）重组vsocs基因缺失病毒转移载体的构建（图1）：通过PCR扩增vsocs基因在ISKNV基因组上下游各约1000bp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真核表达载体pEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载体的vsocs基因上下游片段之间，该克隆载体为vsocs基因缺失病毒转移载体；

（2）细胞的制备：将鱼类细胞系经酶消化分散后，进行细胞培养成片，用于接种肿大细胞病毒；

（3）重组vsocs基因缺失病毒的接种和培养：上述鱼类细胞培养成片后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入重组vsocs基因缺失病毒液，进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感染上清，加入细胞维持液，再次进行细胞培养，至细胞出现明显病变为止；

（4）重组vsocs基因缺失病毒液的收集、稀释和保存：将上述病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，经0.22μm滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80℃冰箱中，即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品；