[发明专利]一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：

一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO₂体积含量为5％、温度为37℃的环境中培养16～18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3-5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于6～7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种；

二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17～18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h；

制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37～38℃温室中静止培养18～20h，期间每隔6～8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液；

菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液；

(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同；

(3)鸡毒支原体抗原液的制备，按照以下步骤进行：

一级种子繁殖：将CM培养基1ml注入冻干菌种瓶使菌种复原，再将体积为CM培养基体积1/10的鸡毒支原体菌种接种于CM培养基中，在温度为36～37℃条件下培养24～48h，待接种后的CM培养基的PH值与接种前的PH值相比下降0.5～0.8时停止培养，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级种子，在-25℃以下保存不超过60天；

二级种子繁殖：取一级种子，按体积为CM培养基体积1/10的量接种于CM培养基，置36～37℃温度下培养24～48h，经纯粹检验合格后，作为二级种子，在2-8℃保存不超过5天；

制苗用菌液制备：再以纯粹检验合格的二级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出三级种子，再以纯粹检验合格的三级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出四级种子，比照二级种子繁殖方法做种子扩大培养，菌种繁殖传代不超过8代，最后一代纯粹检验合格，经活菌计数测定，活菌数不低于10^8.5ccu/ml，得到制苗用菌液；

菌液浓缩与灭活：将制得的制苗用菌液作8倍浓缩后，加入体积为浓缩物体积1/500的甲醛，在温度为37℃条件下灭活20h，期间每隔6h摇动1次浓缩物，经无菌和灭活检验合格得到鸡毒支原体抗原液，置2-8℃保存不超过20天；

(4)疫苗的制备：将上述制得的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1～1∶1.5的比例混匀后倒入乳化罐内，用混合机以750～850r/min的转速搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，然后将混合机转速提高到2500～3000r/min继续乳化30～60分钟，即得到疫苗，疫苗中A型副鸡嗜血杆菌和C型副鸡嗜血杆菌的最终含菌量均为10亿cfu/ml、鸡毒支原体的最终含量为10^8.0ccu/ml；

所述鸡肉汤琼脂板是这样制备的：取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g混合，用4mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的PH至7.4，116℃灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I(NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混匀，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0.05％、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10％，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1份加蒸馏水4份，4℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的；

所述半合成培养基是这样制备的：取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入1000ml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7.2～7.4，116℃灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和10ml的质量百分浓度为0.5％的辅酶I(NADH)水溶液；

所述CM培养基是这样制备的：将PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水1000ml、浓度为1％的酚红1ml混合溶解后，在温度为115℃压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟，置2～8℃保存，使用前加入猪血清130ml、25％的酵母浸出液100ml和80万单位/ml青霉素溶液1.2ml，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为7.8～8.0；

所述浓度为1％的酚红的制作过程：(1)1mol/L氢氧化钠的制备，取常温下的澄清的氢氧化钠饱和溶液56.0ml，加煮沸过的常温注射用水1000ml即制得1mol/L氢氧化钠；(2)称取10.0g酚红粉末加入到20.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液中搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(3)向未溶解的酚红粉末中再加入20ml的1mol/L氢氧化钠溶液搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(4)如果酚红粉末未完全溶解，则可再加少量1mol/L氢氧化钠溶液，但不得超过20.0ml，将溶液倒入1000ml刻度容器中；(5)加煮沸过的常温注射用水向刻度容器中补足溶液至1000ml，摇匀后分装小瓶，经116℃灭菌15分钟，置2～8℃保存；

所述25％的酵母浸出液的制作过程：取新鲜酵母250g加入到1000ml双蒸水中充分搅拌，使酵母溶解完全，煮沸30分钟，煮完冷却后，以2800r/min转速离心25分钟，提取上清液分装，在温度为115℃、压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟。