[发明专利]一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品制备与禽病防治技术领域，尤其涉及一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法。

背景技术

鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的一种急性呼吸系统传染病，主要特征为面部肿胀、鼻腔有浆液性到粘液性分泌物和结膜炎，发病率很高，呈世界性分布。鸡毒支原体病(MG)是鸡的一种慢性呼吸道传染病，具有分布广泛、感染率高的特点，以呼吸道发生啰音、咳嗽、流鼻液和窦部肿胀为特征。传染性鼻炎或鸡毒支原体单独感染可致死鸡只，但危害更甚的是常继发或并发感染大肠杆菌病、传染性支气管炎等多种细菌病和病毒病。

这两种病的共同特点是造成育成鸡发育不良、蛋鸡产蛋明显下降(比正常低10～40％)，使用药物治疗时，极易产生耐药性，病情常反复发作，无法从根本上消除带菌状态。由于患病鸡的饲料利用率和产蛋率的低下以及医疗费用所带来的经济损失，使这两种病成为养禽业面临着代价最高的疾病问题之一。因此研制鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联灭活疫苗具有重大现实意义。

目前，国内使用的疫苗为鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联油乳剂灭活疫苗，存在粘度大难注射，矿物油难吸收，注射局部易发生肿胀，免疫产生时间长、免疫持续期短等缺点，亟待需要寻求一种易吸收、无毒副作用、效果好的新型佐剂疫苗来防治该病。

杨树皮类脂系从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物质，具有高度的天然生物学活性，富含大量的磷脂、甾醇、不饱和脂肪酸、糖脂以及多种常量、微量元素、多种维生素、18种必需氨基酸等。其中杨树皮类脂中含有的多糖类、有机酸、甾醇、甙类、黄酮类物质在动物体内协调统一，可以大大提高动物体的免疫机能。多糖类具有促胸腺体液反应、刺激网状内皮系统，提高机体特异性免疫反应能力；有机酸具有增强机体免疫功能的作用，能够刺激和促进单核吞噬细胞功能，对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用；甙类能够加速抗体的产生、促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用。国内也有用类脂做为佐剂制备疫苗的报道，其中，专利号为ZL03142556.9的发明专利公开了杨树皮类脂做为疫苗佐剂的使用方法：(1)500～1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4～6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10～15MPa，剪切压力为45～60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20～30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。使用该方法制得的疫苗效果好，但类脂含量高、制造成本高，且免疫持续时间不长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有疫苗的缺陷，提供一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，依本发明所制备的疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长，免疫效果好，能有效预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体病，且制造成本低。

本发明的技术方案是这样实现的，一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：

一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO₂体积含量为5％、温度为37℃的环境中培养16～18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3-5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于6～7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种。

二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17～18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h。

制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37～38℃温室中静止培养18～20h，期间每隔6～8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液。

菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液。

(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同。