[发明专利]一种坏死梭杆菌的基因检测分型方法及试剂盒

权利要求书

1.一种坏死梭杆菌快速检测分型的方法，根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条特异性引物，两个亚种FNN和FNF分别扩增出1076 bp和809 bp的特异性片段，其中P1和P2分别位于坏死梭杆菌FNN亚种和FNF亚种白细胞毒素启动子区，P3为下游公共引物；

引物如下：

P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3

P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3

P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3

具体步骤如下：

1）采集并初步处理待检样品；

2）从样品中抽提DNA；

3）使用上述特异性引物进行PCR扩增；

4）对步骤(3)中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带；

5）对电泳结果进行分析，确定样品中是否有坏死梭杆菌以及是坏死梭杆菌的哪个亚种感染。

2.实现权利要求1所述坏死梭杆菌检测分型方法的试剂盒，其特征在于：

由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、坏死梭杆菌基因特异性引物对和阴性质控标准品；

P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3

P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3

P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3

标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守基因的1 076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUC18-T重组载体或其他重组载体。

3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：

PCR反应液：由上述3条引物P1、P2、P3，10×PCR Buffer(含Mg2+)，dNTP混合物及无菌双蒸水组成。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是坏死梭杆菌标准阳性模板所包含的Fnn型和Fnf型白细胞毒素启动子区的核苷酸序列见SEQ ID No.1、SEQ ID No.2。

5. 权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）DNA提取液：包括如下组分：PBS（137mM Nacl,2.7 mM Kcl,10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,PH7.4）,10×TE（0.1 M Tris-HCl ，0.1 M EDTA, pH 8.0)；

2）PCR反应液：由3条引物 P1、P2、P3，10×PCR Buffer(含Mg2+)，dNTP混合物及无菌双蒸水组成；

3）标准阳性模板：含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守基因的1076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUC18-T重组载体或其他重组载体；

4）坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区基因特异性引物序列：

  P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3

P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3

P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3

5）阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。