[发明专利]一种坏死梭杆菌的基因检测分型方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种坏死梭杆菌的基因检测分型方法及试剂盒。根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条引物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法和试剂盒，达到特异、灵敏和快速对坏死梭杆菌进行检测分型，并能够快速诊断坏死梭杆菌引起的腐蹄病、肝脓肿等，属于医疗诊断技术领域。

背景技术

坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum，简称Fn）是一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态杆菌(长丝到短杆状)，它广泛存在于动物和人的口腔、胃肠道及泌尿生殖道中，是一种条件致病菌。

通过DNA-DNA同源性分析，坏死梭杆菌被分为两个生物亚型：F. necrophorum subsp. Necrophorum（简称Fnn）和 F. necrophorum subsp. Funduliforme（简称Fnf），前者主要感染家畜；后者对动物的致病力较低，主要引起人类发病。尽管坏死梭杆菌的两个生物亚型均能引起疾病，但是Fnn更经常从坏死病灶中分离到，通常认为Fnn比Fnf具有更强的致病性^[2]。这两个亚种主要在菌体形态、菌落特征、肉汤培养基中的生长模式、红细胞凝集作用、溶血活性、白细胞毒素活性、LPS的化学组成以及对小鼠的致病力等方面存在差异。

坏死梭杆菌的常规鉴定方法主要是菌体形态、菌落特征、生化试验、耐药性试验、血清学试验和酶特性试验等。由于坏死梭杆菌是严格厌氧菌，培养条件相当苛刻，必须在严格无氧的条件下才能生长，而且同一分离菌株在不同代次甚至不同培养管间呈现出不同的形态，因此从菌体形态上很难对其进行初步鉴别；另外对坏死梭杆菌的分离纯化也相对困难，需要在加有抗生素（坏死梭杆菌不敏感）血琼脂平板中才可能进行纯化，否则大量杂菌的生长会抑制坏死梭杆菌的生长，从而导致使用常规的鉴定方法耗时、费力、误诊率高，很难对坏死杆菌病做出及时准确的诊断。

研究发现坏死梭杆菌两个亚种白细胞毒素（lkt）操纵子的启动子区存在差异，且每个亚种lkt启动子区高度保守，因此可以使用这个独特的启动子序列来鉴别坏死梭杆菌两个亚种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种坏死梭杆菌快速检测分型的方法，通过聚合酶链式反应(PCR)检测生物样本中的坏死梭杆菌。

本发明还提供了利用上述方法制备的试剂盒，用于快速检测坏死梭杆菌。

本发明的技术解决方案如下：

根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条特异性引物，两个亚种FNN和FNF分别扩增出1076 bp和809 bp的特异性片段，其中P1和P2分别位于坏死梭杆菌FNN亚种和FNF亚种白细胞毒素启动子区，P3为下游公共引物。

引物如下：

P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3

P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3

P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3

本发明所述坏死梭杆菌的基因检测分型方法，它的检测步骤如下：

1、采集并初步处理待检样品。

2、从待检样品中抽提DNA。

3、使用上述特异性引物按照优化好的条件进行PCR扩增。

4、对步骤3中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带。

5、对电泳结果进行分析，确定样品中是否有坏死梭杆菌以及是坏死梭杆菌的哪个亚种感染。

所述的坏死梭杆菌检测分型方法，进一步阐述此检测方法的详细步骤如下：

1、样品采集 将怀疑患有腐蹄病的牛羊蹄部用清水刷洗干净，使用削蹄刀刮除蹄部腐烂创口的表面坏死组织，用高压灭菌后的棉拭子沾取病健结合处的组织或脓汁，将拭子放入灭菌的冻存管中，低温冷藏保存备用。