[发明专利]一种泥鳅霍乱弧菌疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种泥鳅抗病疫苗的制备方法，特别是涉及一种泥鳅霍乱弧菌疫苗的制备方法；本发明还涉及该疫苗的免疫使用方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高，有“水中人参”美誉的泥鳅的需求量不断提高，尤其是由于韩国、日本等周边市场对我国泥鳅的大量需求，泥鳅已经成为我国出口创汇水产品的重要组成部分，我国每年出口产值达数十亿元。江苏连云港地区已形成了泥鳅大规模人工集约化养殖，但由病原细菌引起的疾病，给泥鳅养殖生产造成了很大的经济损失。近年来我们在对泥鳅细菌性疾病调研中，发现霍乱弧菌可引起泥鳅感染发病，并严重危害泥鳅养殖生产，该菌广泛分布于水环境，已知有不少血清型株能引起水产动物感染发病，可引起人散发胃肠炎，在特殊条件下也可引起败血症、脑膜炎、伤口感染等肠道外感染，是人和水产养殖动物共染的病原菌。在泥鳅细菌性疾病防控方面，大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制疾病的发生与流行，但在长期的药物使用中，药物在动物体中残留，危害到人类的健康，且长期用药带来环境污染，并导致耐药性微生物大量出现，同时已成为出口创汇的壁垒，严重影响了养殖业的发展。因此，应用免疫学技术预防泥鳅细菌性疾病的发生已迫在眉睫。

现有技术中尚未有泥鳅抗病疫苗方面的研究，目前养殖户大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制疾病的发生与流行，市场上没有一种适用于泥鳅的针对霍乱弧菌的疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题的是针对现有技术的不足，提供一种提高泥鳅免疫力、降低泥鳅养殖生产中由病原霍乱弧菌所造成的危害、以满足泥鳅养殖生产上的抗病需求的泥鳅霍乱弧菌疫苗的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术是提供了几种如上所述的泥鳅霍乱弧菌疫苗的免疫使用方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种泥鳅霍乱弧菌疫苗的制备方法，其特点是：它以泥鳅病原霍乱弧菌LD081008B-1(Vibrio cholerae LD081008B-1)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如下：

(1)将霍乱弧菌LD081008B-1菌株接种在普通营养肉汤培养基上，28-30℃培养18-24h后，加入体积终浓度0.3％的甲醛28-30℃灭活48h，得灭活菌体；

(2)取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；

(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得水剂型黄芪佐剂泥鳅霍乱弧菌疫苗；二者的混合比例为：每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为3.2×10⁸cells。

以上所述的制备方法所制得的泥鳅霍乱弧菌疫苗的一种免疫使用方法是：它采用浸泡免疫的方法，先将受免泥鳅在充气条件下用质量浓度为8％的NaCl溶液浸泡5min，然后按体积比1∶5用水稀释泥鳅霍乱弧菌疫苗得泥鳅霍乱弧菌疫苗溶液，再将受免泥鳅放于泥鳅霍乱弧菌疫苗溶液中充气浸泡1h，一周后按前述方法加强免疫1次。

以上所述的制备方法所制得的泥鳅霍乱弧菌疫苗的又一种免疫使用方法是：它采用注射免疫的方法，取体长为8-12cm的泥鳅按0.1mL/尾的免疫剂量进行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。

以上所述的制备方法所制得的泥鳅霍乱弧菌疫苗的再一种免疫使用方法是：采用口服免疫方法，将硬颗粒饲料用泥鳅霍乱弧菌疫苗浸泡后投喂，每天鱼体摄入灭活菌体量为3.2×10⁶cells/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免疫一周。

本发明中所述的霍乱弧菌LD081008B-1(Vibrio choleraeLD081008B-1)已经在《泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定》中公开，该公开文献的发表刊物为：《海洋与湖沼》，2009，40(6)：692-698.该菌株的分离菌DNA序列长度及登录号如下表：

分离菌DNA序列长度及登录号

本发明所涉及的菌株霍乱弧菌LD081008B-1(Vibrio choleraeLD081008B-1)为公知公用材料，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。