[发明专利]一种利用木瓜蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白制备的抗冻多肽

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗冻多肽，更具体地涉及了一种利用木瓜蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白制备的抗冻多肽，属于生物技术领域。

背景技术

食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面临严肃的挑战：如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药产品品质的关键所在。

抗冻蛋白（antifreeze proteins, AFPs）或者称“冰结构蛋白”（ice structuring proteins），是一类附着在冰晶体（ice crystals）表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题，近年来国内外对抗冻蛋白的研究十分活跃,《Nature》和《Science》密切跟踪报道抗冻蛋白方面的最新研究进展。目前的研究主要集中在从极地鱼类、陆地昆虫、植物和细菌等生物体中分离到多种抗冻蛋白，并寻求它们在食品、医学和其它工业上的应用。伴随着多种抗冻蛋白的发现和研究的深入，其制约生物体抗冻蛋白的研究和应用的二大关键问题也日益凸现： 1.天然分离纯化所得到的数量微少，非常有限的数量限制了它在食品和医学上的大规律应用前景； 2.当科学家致力于转基因技术以扩大生物体来源的抗冻蛋白产量时，转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑又成为广大消费者、欧盟组织和国际FDA组织所共同担忧的焦点问题。

同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍然需要探究其活性域来进一步提高抗冻效率。 所以,如何获得食品源的结构紧凑的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用木瓜蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白制备的抗冻多肽，使抗冻活性得以高效地实现。

本发明的一种抗冻多肽，氨基酸序列为Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly。所述抗冻多肽由16个氨基酸残基所构成。

所述抗冻多肽的制备方法如下：

以猪皮胶原蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽；酶解条件为：pH为7.0、温度是37℃、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:10（w/w）；所述酶为木瓜蛋白酶；所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为1mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC－C18反相高效液相色谱再进一步的分离，反相HPLC的分离以10%-90% 乙腈溶液梯度洗脱，流速为1mL/min，收集最具活性的峰，得到高纯度的特异性抗冻多肽。

为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：

(1)    胶原蛋白酶解条件的优化

本发明所采用的酶和猪皮胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司（中国·上海）。

采用单因素实验，分别对三个酶解因素进行考察，分别为酶解温度（37℃，45℃和55℃）、酶解时间（10，20，30，40和60分钟）以及酶-底物配比（1:100,1:50,1:20,1:15和1:10 w/w）。称取1.65克猪皮胶原蛋白溶解于6ml半胱氨酸浓度为10mM/L的 Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是：pH为7.0、温度是37℃、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:10。

(2)    酶解产物的分离、纯化