[发明专利]胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体及其获得方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种改造肽配体(altered peptide ligand，APL)，特别涉及胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表位mInsB_5-14的APL，还涉及该APL的获得方法和应用。 

背景技术

I型糖尿病(Type I diabetes)是由淋巴细胞介导的以胰岛β细胞特异性损伤导致胰岛素生成绝对不足为特征的一种自身免疫性疾病。I型糖尿病多发生在儿童和青少年，起病急，如不及时治疗可引发累及心、肝、肾、神经、眼等重要组织器官的严重并发症，是儿童和青少年致残及早亡的主要原因之一。近年来，我国儿童和青少年患I型糖尿病的人数逐年递增，I型糖尿病正在成为危害我国儿童和青少年健康的主要疾病。目前，I型糖尿病以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，治疗费用高昂且副作用大，因此，急需建立一种特异性免疫干预治疗策略。 

大量动物实验证实，给非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接种自身抗原，可以减缓甚至完全阻断I型糖尿病的发生、发展。既往研究发现，不管是糖尿病患者还是NOD小鼠，自身反应性Th1细胞在I型糖尿病的致病机制中占中心地位，因此，近年来发展了用自身反应性CD4⁺T细胞表位替代完整自身抗原来诱导免疫耐受的策略。相对于结构复杂的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易诱导免疫耐受、相对安全、易于实现规模化制备和纯化等优点，最为重要的是可以通过一些氨基酸位点的化学修饰最大限度地增强其免疫调节的能力。例如，源于胰岛素B链的mInsB_9-23是优势性自身反应性CD4⁺T细胞表位，Alleva等采用丙氨酸突变扫描技术筛选出一条将mInsB_9-23的第16位和第19位氨基酸 同时替换为丙氨酸的APL，该APL免疫NOD小鼠后可以有效诱导Th1→Th2型应答转换，从而阻断I型糖尿病的发生。源于热休克蛋白60的Hsp60_437-460也是一个优势性自身反应性CD4⁺细胞表位，Raz等将其第6位和第11位的氨基酸同时替换为缬氨酸后获得了一条稳定性更强的APL，该APL可以有效诱导Th1→Th2型应答转换，在一定程度上减轻或者阻断β细胞的免疫损伤，但临床研究显示其对I型糖尿病的防治效果却因人而异，可能是由于免疫应答类型转换在尺度上很难把握，一旦Th2辅助的体液免疫过分加强后，疾病最终转归则变得难以预料，这使得以调节CD4⁺T细胞应答为目的的免疫干预策略陷于尴尬境地。 

近年来在NOD小鼠模型研究中有愈来愈多的证据表明自身反应性CD8⁺T细胞(即CTL)在I型糖尿病中同样具有十分重要的致病作用，其识别β细胞上的自身抗原CTL表位与MHC-I类分子形成的复合物，通过Fas/FasL、释放穿孔素等途径直接杀伤β细胞。已有研究利用自身抗原CTL表位或其APL在NOD小鼠体内成功诱导了特异性CTL免疫耐受，对I型糖尿病有一定的防治作用。 

同时研究报道，I型糖尿病的发生与人类HLA-A*0201分子密切相关。据统计，约60％的I型糖尿病患者携带HLA-A*0201等位基因。在HLA-A*0201转基因NOD小鼠[NOD.129P2(B6)-β_2m^tmlUncTg(HLA-A/H2-D/β2M)]中，I型糖尿病的发病时间较普通NOD小鼠提前且程度加重，是良好的人源化动物模型。近年来已陆续鉴定出一系列人和小鼠I型糖尿病自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在较高的人、鼠交叉反应性。因此，利用人源化NOD小鼠筛选对自身反应性CTL具有负调节效应的APL，对于人类I型糖尿病的防治研究具有重要意义。 

在人源化NOD小鼠中，源于胰岛素B链的mInsB_5-14(即鼠源胰岛素B链第5到14位氨基酸)已被证实为HLA-A*0201限制的免疫优势性CTL表位，且与人源表位具有高度的交叉反应性。因而，通过改造天然表位mInsB_5-14来获得在HLA-A*0201背景下能显著下调mInsB_5-14特异性CTL应答水平的APL，对于人 类I型糖尿病的防治研究具有重要的实际意义和良好的应用前景。 

发明内容