[发明专利]一种植物表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体。

背景技术

20世纪以来，基因工程育种一直被认为是改良植物产量、品质和抗逆性的有效途径。事实上，利用基因工程育种技术已经培育了一些转基因植物新品种，如转基因大豆、棉花、玉米和油菜等，并在生产实践中得到了大面积应用。尤其近5年来，植物转基因研究的发展非常迅速，利用转基因方法培育的植物品种逐年增加。同时，由于很多国家政府和消费者对转基因植物安全性的重视，以及转基因植物内在的安全性障碍，多数转基因植物品种难以获准商业化生产。其中，筛选标记基因的存在是转基因植物安全性的最大隐患之一。

选择标记基因的广泛应用虽然提高了获得转基因植物的效率，但由于选择标记基因大多属于编码抗生素或除草剂的抗性基因，随着选择过程的结束，这些外源选择基因在植物基因组中的存在和表达变的多余，且它们会随着转基因植物的繁育而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。

转基因植物安全问题主要体现在食品安全和环境安全二个层面。在食品安全方面，抗生素类基因及其产物对人类或者畜牧可能具有潜在毒性及致敏性，一旦食物中有所残留，它们将有可能传入微生物中，进而可能增加人或动物消化道内的微生物数量，危及人及牲畜的健康。在环境安全方面，选择标记基因有可能会通过基因漂移传播到野生近缘种中，使杂草获得相应抗性，导致超级杂草的出现，此外，选择标记基因传播到其他生物体中，可能会破坏生态系统的平衡。选择标记基因及其他冗余基因的剔除，可降低转基因植物的潜在风险，利于转基因植物安全评价和推广。故此，培育安全型转基因植物是目前的研究热点之一。

获得转基因植物涉及到的筛选标记有二类，其一是细菌筛选标记，如amp、kan、aadA等，用于筛选构建的载体及转化的细菌；其二是植物筛选标记，如nptII、bar、hpt等，用于筛选转化的植物细胞和再生植株。基因枪介导法不但转入了植物筛选标记，也转入了细菌筛选标记。农杆菌介导法虽然可以避免将细菌筛选标记引入植物，但位于同一T-DNA区域的目标基因与筛选标记转入植物后紧密连锁。鉴于此，人们先后提出了几种获得无筛选标记转基因植物的技术，包括共转化法、定位重组体系、多元自动转化载体系统、转座子系统和同源重组体系等，但只有共转化法应用最为成功。基因枪介导的共转化法虽然可以去除植物筛选标记，但不能去除细菌筛选标记。农杆菌介导的共转化法不但可以避免将细菌筛选标记转入植物，而且可以避免将nptII、bar、hpt等筛选标记转入植物，在获得安全型转基因植物方面具有独特优势。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物表达载体。

本发明所提供的表达载体，按照包括如下步骤的方法得到：在出发表达载体pZP201的HindIII和EcoRI酶切位点间插入SEQ ID NO：4所示DNA片段，得到中间载体I；再向中间载体I中的ScaI和ScaI酶切位点间插入含有如下片段的DNA片段：LB、RB和SEQ ID NO：3所示DNA片段，得到目的表达载体；

其中，RB位于SEQ ID NO：3所示DNA片段的5′端上游，LB位于SEQ ID NO：3所示DNA片段的3′端下游；

所述RB的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述LB的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。

本发明所提供的表达载体，还可以按照包括如下步骤的方法得到：

(1)用HindIII和EcoRI酶切载体pZP201，回收载体大片段；用HindIII和EcoRI酶切载体pWMB006，回收4.0kb片段；将所述载体大片段与所述4.0kb片段连接，得到重组载体，记作pWMB011；

(2)用KpnI和SacI酶切pWMB011，回收载体大片段；用KpnI和SacI酶切pBluescript II-KS(-)，回收108bp片段；将所述载体大片段与所述108bp片段连接，得到重组载体，记作pWMB012；

(3)以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示DNA片段为引物，以pCAMBIA3301载体为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；用HindIII和EcoRI酶切PCR扩增片段，回收酶切产物；用HindIII和EcoRI酶切载体pZP101，回收载体大片段，将所述载体大片段与所述酶切产物连接，得到重组载体，记作pWMB010；

(4)用ScaI酶切pWMB012，回收载体大片段；用ScaI酶切pWMB010，回收3.0kb片段，将所述载体大片段与所述3.0kb片段连接，得到重组载体，即为目的表达载体；