[发明专利]猪蓝耳病病毒与疫苗及二者的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及猪蓝耳病病毒与疫苗及二者的生产方法。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征，是一种危害养猪业的病毒性传染病。2006年夏秋季，我国南方部分省份发生猪“高热病”疫情，农业部积极组织科研人员联合攻关，确定猪蓝耳病变异病毒为主要病原，定名为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法，目前商品化的蓝耳病疫苗主要是由经典株制备的弱毒苗和由变异株制备的灭活苗。而这两种疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的所希望的高产量来说具有重大意义。

为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。

中国专利CN101307304A公开了利用Marc-145细胞生产蓝耳病病毒JXA1-R株的方法，其采用的方法是传统的转瓶工艺。现有的蓝耳病病毒大规模生产采用转瓶培养生产的传统培养模式，有如下缺点：(1)作坊式生产，劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小；(2)细胞生长密度低，产量低；(3)收获病毒液后，后续混合，存在批间差，均一性不好；(4)培养时各项监测和控制环境条件受到限制等。上述缺点造成了蓝耳病病毒滴度不高，限制了产品的产量、质量的提高和生产成本的降低。因此，本领域中仍迫切需要能够进一步改善生产蓝耳病病毒疫苗的方法。

发明内容

本发明主要目的是提供一种蓝耳病病毒及疫苗的生产方法，包括如下步骤：

1)微载体生物反应器中，加入1.5×10⁷～4.5×10⁷cells/g微载体的传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序，使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；

2)上述传代细胞培养至6.0×10⁹cells/L～2.6×10¹⁰cells/L时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I.＝0.0001～1.5接种猪蓝耳病病毒，启动病毒吸附程序，使病毒与微载体上的细胞吸附完全后，换用病毒培养程序，扩增猪蓝耳病病毒；

3)生物反应器中收获猪蓝耳病病毒液；

4)收获的病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪蓝耳病灭活疫苗；收获的病毒液加入冻干保护剂进行冻干，制得猪蓝耳病活疫苗。、

优选地，本发明所述的生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。

更优选地，本发明所述的生物反应器为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。

优选地，所述微载体为片状、球形或网状。

优选地，所述的微载体的成分为聚酯、明胶或多糖。

更优选地，所述的微载体为网状的聚酯纤维，

优选地，所述的微载体的添加量为40～75g/L。

优选地，本发明所述的生物反应器为潮汐式生物反应器的程序：载体上下运行频率为0～10mm/s，培养液面在载体瓶中上下端点停留时间为0～2min。

优选地，本发明所述的步骤3)中所述的猪蓝耳病病毒液的体积为2.5L～1000L。

优选地，本发明所述制苗用细胞为CL2621细胞、MA104细胞、Marc-145细胞或其他传代细胞株。

优选地，本发明步骤2)中所述细胞生长液，配方为MEM培养基加3％～5％的牛血清，培养条件为温度36.5℃～37.5℃，pH值调节7.0～8.0，溶氧调节10％～80％，二氧化碳浓度为0％～10％。。

优选地，步骤3)中所述细胞维持液使用MEM培养基加0.5％～1.5％的牛血清配制而成，其培养条件为控制在36.5℃～37.5℃，pH调节7.2～7.5，溶氧调节25％～80％，二氧化碳浓度为1％～5％。

优选地，本发明步骤3)中所述的收获病毒液为分批培养收获。

本发明的另一方面为由上述方法制备的猪蓝耳病病毒。

本发明的又一方面为由上述方法制备猪蓝耳病病毒在疫苗生产中的应用。

本发明采用把Marc-145细胞接种到生物反应器中，待其长到一定密度后，接种猪蓝耳病病毒液，在生产过程中调节各种控制参数，如pH值、DO值、灌流速度、优化接种病毒的感染复数(M.O.I.)，同时，还要掌握好接种病毒时细胞的密度和接毒时间等，使病毒在高密度的生物反应器中高效繁殖，分批培养收获病毒，并能进一步提高病毒的滴度。

技术效果