[发明专利]类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因的分离及其编码的蛋白质制备方法，以及其在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用。

背景技术

在过去的50年内，石油化工塑料已是应用最多的材料，主要是因为这类塑料具有多种结构、多种性能，且原材料价格低廉。目前这类塑料产量年增长速度为9.9％，但给人类带来了重要的的“能源问题”和“环境问题”。

生物降解塑料是近些年发展起来的被全球公认的一种真正绿色环保塑料，易于被环境中的有机物质代降解，从根本上解决“白色污染”问题。目前全球研发的生物降解塑料品种已有几十种，其中聚羟基脂肪酸酯(PHA)是其中最为活跃的研究热点。PHA作为一种“生物可降解塑料”除用于环境友好型包装之外，还可用与热敏胶、压敏胶和水溶胶及拉成纤维等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作为医用植入材料和可控药物缓释载体，PHA的寡聚物可作为酮体供体的营养添加剂，PHA的手性单体作为药物或手性合成的中间体，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分离；PHA合成基因还可用于调节微生物的新陈代谢，调节微生物于逆境条件下的生存能力，由此可用于改造工业微生物菌株，提高微生物发酵的效率等。作为生态环境友好型塑料，PHA是最具环保和最具发展前景的绿色塑料之一，该类塑料的不断开发和应用领域的不断拓宽将会给人类生活带来极其深远的影响。

PHA的生物合成是一个受多种酶参与催化、由不同的代谢途径控制的复杂过程。PHA合成需要β-酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA聚合酶。此外，(R)-专一的烯酰辅酶A水合酶(PhaJ)能通过脂肪酸的β-氧化提供合成PHA的前体物，它的使用为脂肪酸在重组菌株中合成PHA提供了有力的工具。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)基因MaoC及其蛋白质制作技术，以及应用该基因编码的类单胺氧化酶C类脱水酶在制备生物降解物质聚羟基脂肪酸酯上的应用，该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子，通过特异性酶活测定实验，证明了该基因编码的蛋白质具有合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生物活性，酶活力达到58.1U/mg。因此，该基因可有效合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为进一步应用可生物降解物质即绿色塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技术储备。

本发明所提供的类单胺氧化酶C类脱水酶基因，其特征在于：其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

该基因有897个碱基，编码一种含有298个氨基酸的蛋白质，分子量为33kDa，无信号肽序列，无内含子。

类单胺氧化酶C类脱水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)是最近发现的一种新乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)，该酶在脂肪酸β-氧化至PHA的合成过程中提供(R)-专一的羟烷基辅酶A(R-3-hydroxyacyl-CoA)。MaoC已经被证明对底物巴豆酰辅酶A(Crotonyl-CoA)具烯醇基辅酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性。MaoC因具乙酰辅酶A脱水酶(Enoyl-CoA hydratase)活性而成为与PHA合成相关的众多酶类成员之一。

而本发明所提供的MaoC基因与JGI(jgi/phycaf7/20609)中的辣椒疫霉全基因组序列中的MaoC基因氨基酸序列比对，同源性达99.33％，核苷酸序列有14个碱基的差异，氨基酸序列有2个氨基酸的差异，这种差异与菌株来源的不同有关，因此本发明所分离获得的MaoC基因是一个新的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因，本发明提供的有关MaoC基因具有聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶功能特性的信息具鲜明的原创性。

为了能够更好的将其应用，发明人提供了一种制备本发明所述MaoC基因及蛋白的分离制备方法

1、基因克隆具体步骤：

A：采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组DNA，备用；

B：根据2008年由美国能源部基因研究所(U.S.Department of Energy Joint GenomeInstitute--DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因组草图序列，经生物信息学分析获得目的基因(MaoC)序列，设计特异引物(其序列如Seq ID No：3及Seq ID No：4所示)经PCR克隆获得基因全长；