[发明专利]一种胰岛素和C肽双标记测定试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种胰岛素和C肽双标记试剂盒，特别是涉及一种以滤纸干血片为样本使用双标记时间分辨免疫荧光法进行胰岛素和C肽测定的试剂盒，利用本试剂盒一次测试可以同时定量检测胰岛素和C肽两种标志物。本发明试剂盒的应用解决了血清样本中胰岛素和C肽不稳定的问题，可广泛用于糖尿病的辅助诊断和病情检测，指导临床用药以及预后等多个研究领域。

背景技术

糖尿病(DM)是一种常见多发病，也是世界卫生组织所列三大疑难病之一，如何防治DM是现代医学界的一大难题.DM分为I型(胰岛素依赖型)和II型(非胰岛素依赖型)，其实验室分型依据主要依赖胰岛素及C肽释放试验。

胰岛素及C肽释放试验即在做口服葡萄糖耐量试验的同时，利用口服葡萄使血糖升高而刺激胰岛B细胞分泌胰岛素，通过测定空腹及服糖后1小时、2小时、3小时血中胰岛素和C肽动态变化，来反映胰岛B细胞的功能状况。

胰岛素是从胰岛B细胞分泌的一种能降低血糖的物质。胰岛B细胞合成胰岛素原后，分裂为胰岛素及C肽，二者以同等的数目释放入血循环中。测定血中胰岛素及C肽浓度，可以了解胰岛B细胞贮备功能，对指导治疗具有非常重要的意义。对于那些已经使用外源性胰岛素治疗的糖尿病人，体内可产生胰岛素抗体，干扰胰岛素测定，而测定血中C肽水平不仅可以准确地反映B细胞功能，而且可以弥补胰岛素测定的不足。临床上，常常将葡萄糖耐量试验，胰岛素及C肽释放试验同时检测。

常规的血清胰岛素和C肽检测大多采用酶联免疫法(ELISA)、化学发光法和时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)。

酶联免疫法试剂盒均为半定量试剂，不能为临床医生提供精确的定量值，很难有效指导临床的治疗。同时，由于该方法本身在灵敏度上的局限性，对于血清胰岛素和C肽含量的变化还无法有效检测，影响了临床医生的判断。

时间分辨免疫荧光分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。因此，本发明选用TRFIA技术研制胰岛素和C肽检测试剂盒。

胰岛素分子量5700道尔顿，由两条氨基酸肽链组成，C肽是由21个氨基酸组成的直链，分子量3020道尔顿，均可以采用双抗体夹心法进行检测。

铕和钐是TRFIA技术中常用于双标记分析中的一对稀土元素。他们的激发波长均为340nm，均能利用β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)螯合剂增强荧光强度。铕和钐最大发射波长分别为613nm和643nm，虽然相差不大，但由于是窄峰发射，能够充分分辨；另外铕和钐荧光寿命相差显著，分别为820μs和88μs，检测时彼此干扰比较小。本发明采用铕标记C肽抗体、钐标记胰岛素抗体，利用TRFIA技术在一份样本中同时定量测定胰岛素和C肽，除了拥有TRFIA技术的固有特点外，还具有省时、经济和高效等突出优点。

常规实验方法以血清作为检测样本。而胰岛素和C肽在血清中稳定性较差，特别是C肽。血清样本(2-8)℃放置3天，胰岛素和C肽浓度将下降10％以上。本发明采用滤纸干血片为载体，采集病人手指或足跟血，滴制血片，晾干。胰岛素和C肽在滤纸干血片中(2-8)℃保存7天，活性无明显下降。本发明采用滤纸干血片作为样本，大大提高胰岛素和C肽的检测结果的稳定性，更适合于临床应用。

本发明的试剂盒选用滤纸干血片为检测样本，并整合双标记时间分辨荧光分析技术，具有灵敏度高、稳定性好、省时、高效等显著优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双标记时间分辨免疫荧光分析技术同时进行胰岛素和C肽定量测定的试剂盒。

为了实现本发明，需要对试剂盒所使用的原料进行筛选，从而确定最佳的原料，这一筛选过程包括包被和标记抗体的活性、标记物和抗体的比例、包被抗体的浓度、标记物的稀释度、包被板的吸附性能和变异大小等。由于铕和钐的标记和纯化方法与酶联免疫分析完全不同，通过反复探索和试验比对，最终找到了简便、效率高、成本低、质量可靠的方法。

同时本发明通过研究确定了试剂盒的组分及配方，包括：洗液配方、分析缓冲液配方、增强液配方、校准品基质的配方等，并公开了铕和钐标记抗体的制备过程。

基于本发明目的，其中所述的试剂盒包括：

1)校准品干血片；

2)包被反应板；

3)标记物；