[发明专利]一种乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肽聚糖微胶囊的制备方法。

背景技术

乳酸菌属革兰氏阳性厌氧菌，是人类肠道中的重要益生菌，对机体有多种生理作用。肽聚糖(peptidoglycan，简称PG)是细菌等原核生物细胞壁的特有组成成分。革兰氏阳性细菌不含具有抗原性的脂多糖结构，肽聚糖则被认为是革兰氏阳性细菌细胞壁中能够引起机体免疫反应的主要成份。真核细胞并不含肽聚糖，因此肽聚糖就成了真核生物免疫系统识别的理想靶位，从而增强人和动物的非特异性免疫，并且对动物体内的肿瘤生长有一定抑制作用。

近年来利用生物技术开发大分子药物不断涌现，但这些药物在胃肠道内稳定性差，易变性、易被消化酶降解，不易吸收，大大影响了其口服给药的生物利用度。为此，生物活性药物大多采用注射方式给药，因此，如何减少注射次数、提高药效成为生物活性药物注射给药面临的一个主要问题。肽聚糖是革兰氏阳性细菌细胞壁的主要组成成分，是一种水油两不溶性物质，其具有多种免疫学活性，如可激活补体，调节免疫反应，刺激淋巴细胞细胞增殖，激活吞噬细胞，从而抑制体内肿瘤细胞生长和增强机体抗感染的能力，对于肽聚糖国内外目前基本采用注射方式给药，其原因是口服肽聚糖在胃肠道内稳定性差，容易被消化酶降解，影响了生物利用度；而且肽聚糖作为细菌中提取的生物活性产物，过高剂量用于动物体可能会引起不良反应。

发明内容

本发明目的是为了解决现有细胞壁肽聚糖基本采用注射方式给药，存在口服生物利用度低及过高剂量会引起不良反应的问题，而提供一种乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊的制备方法。

乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊的制备方法按以下步骤实现：一、将L-乳酸菌接种到MRS培养基中，在37℃下富集培养48h，得菌种培养液，经离心、洗涤后收集L-乳酸菌菌体；二、取20g L-乳酸菌菌体悬浮于100mL浓度为100g/L的三氯乙酸溶液中，在75℃水浴中处理25min，冷却至室温后离心并收集沉淀，然后用蒸馏水洗涤沉淀至pH值呈中性；三、按固液比(w/v)1∶5将沉淀加入到胰蛋白酶磷酸缓冲液中，在37℃、转速120r/min的条件下震荡12h，以1500r/min的转速离心5min弃取沉淀，然后取上清液以8000r/min的转速离心15min，得去蛋白的细胞壁沉淀，用蒸馏水洗涤3次后加入氯仿甲醇混合溶液浸泡去蛋白的细胞壁沉淀6h，再以8000r/min的转速离心15min，所得沉淀用无水乙醇洗涤脱水，自然干燥后放入研钵中研磨成粉末，得肽聚糖提取物粉末；四、将50mg肽聚糖提取物粉末和5ml蒸馏水混合后超声处理10min，得悬浊液；五、将50mg壳聚糖和5ml质量浓度为2％的醋酸溶液混合，然后加入悬浊液，搅拌后静止消泡，再滴加到60ml液体石蜡中并磁力搅拌，乳化1h后加入0.15ml质量浓度为50％的戊二醛溶液，交联3h，得反应液；六、反应液以4000r/min的转速离心10min，弃去上清得黄色沉淀，然后依次用石油醚清洗3次、异丙醇清洗2次、蒸馏水清洗1次，即完成乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊的制备。

本发明利用生物可降解的高分子材料壳聚糖，将植物乳杆菌细胞壁中提取的具有免疫调节活性肽聚糖进行缓释微球化；利用三氯乙酸法从植物乳杆菌中提取细胞壁肽聚糖，并利用壳聚糖采用戊二醛交联法将该生物活性产物进行缓释微球化。

本发明所得乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊，通过电镜扫描显示该微胶囊具有良好的成球性，分散性较空白微胶囊有较大提高，载药量为37±3.24％，包封率达92±2.38％，具有降低肽聚糖在胃肠道内的破坏程度，提高活性药物的稳定性，增强其口服生物利用度并且具有药物缓释的作用，且可通过缓释作用避免肽聚糖浓度过高引起的中毒甚至致死反应。

本发明将肽聚糖通过微球化获得可控缓释给药系统，对肽聚糖做为免疫增强剂的进一步研究奠定了基础，同时为新型疫苗的研制提供了参考。

附图说明

图1为具体实施方式一中肽聚糖提取物溶菌酶实验所得曲线图，其中◆表示加溶菌酶，■表示未加溶菌酶；图2为具体实施方式一中肽聚糖提取物糖含量测定的葡萄糖标准曲线图，其中◆表示糖含量；图3为具体实施方式一中肽聚糖提取物脂含量测定的胆固醇标准曲线图，其中◆表示脂含量；图4为具体实施方式一中壳聚糖的电镜扫描图；图5为具体实施方式一中所得乳酸菌细胞壁肽聚糖微胶囊的电镜扫描图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。