[发明专利]一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用

权利要求书

1.一种板层组织工程角膜支架，其特征在于为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80％～95％，拉伸强度为2～5N/mm²。

2.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架，其特征在于所述板层组织工程角膜支架包括未干燥板层角膜支架、干燥板层角膜支架或复水板层角膜支架；所述未干燥板层角膜支架的含水量和膨胀率为75％～90％；所述干燥板层角膜支架是以未干燥板层角膜支架为基础，经过干燥处理的板层角膜支架，所述干燥处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水CaCl₂真空干燥，自然晾干，吹干，30～60℃恒温箱内烘干中的至少一种；所述复水板层角膜支架是以干燥板层角膜支架为基础，经过复水过程处理的板层角膜支架，所述复水过程处理所用的复水剂选自林格氏液，平衡液，1×PBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存液中的至少一种，含水量和膨胀率为75％～90％。

3.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将新鲜动物眼球经过碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，冲洗；

2)消毒后用滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮细胞层；

3)在手术显微镜下作角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，或直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜；

4)将分离的前板层角膜放于角膜枕上，前弹力层面朝下，然后用角膜环钻取3～10mm直径的板层角膜基质片；将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接放于密闭无菌的冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为1～5min，复温时间为3～15min，循环次数为1～5次；

5)将冻融的板层角膜基质片放置于低渗液中浸泡20～120min；

6)将经过步骤5)处理过的板层角膜基质片放于30～40℃恒温箱中，先后于DNA酶孵育60～180min，RNA酶中孵育60～180min，同时在各自的缓冲液中加入0.5～2.5ug/ml的蛋白酶抑制剂，每毫克角膜基质干重含1.10±0.25μg DNA，角膜基质含水量为50％～80％；

7)将经过酶消化的板层角膜基质片放置于电泳液TA液中(作好角膜的电泳方向标记)，然后将整个电泳槽放于密闭消毒盒内，0～10℃恒温冰箱内进行冰浴电泳；

8)将电泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；

9)将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥处理，即得到干燥板层组织工程角膜支架；

10)将干燥板层组织工程角膜支架进行钴60消毒，进行复水处理，得复水板层角膜支架。

4.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤1)中，所述碘伏，是采用质量百分浓度为0.5％～2％的碘伏，所述碘伏浸泡的时间为2～5min；所述用含抗菌素的PBS浸泡的时间为5～10min，所述PBS冲洗，是冲洗3次，每次冲洗的时间为5min；所述抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素或100mg/L链霉素。

5.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤2)中，所述滤纸，是蘸有质量百分浓度为15％～30％酒精的滤纸；所述直接浸泡的时间为1～5min；所述擦除上皮细胞层，是采用棉签或角膜上皮刀擦除上皮细胞层。

6.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤3)中，所述在手术显微镜下作角膜缘切口，是采用宝石刀作深度为3～4mm，厚度为0.8～1.2mm，长为2.5～3.5mm的角膜缘切口；所述直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜的前板层角膜的深度为3～4mm，厚度为0.8～1.2mm。

7.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤5)中，所述低渗液，选自双蒸水或三蒸水。