[发明专利]一种适于培养CHO细胞的培养基及其培养工艺

说明书

技术领域

本发明公开了一种中国仓鼠卵巢细胞的培养基的配制及其培养工艺，更具体地说涉及一种采无血清新培养基用悬浮培养生产重组蛋白治疗药物的培养工艺，属于生物制品领域。

背景技术

诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。其中，基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)是生物制药领域发展最迅猛、销售额最高、产品种类最多的一类产品，是拉动生物制药产业快速增长的主要力量。例如，罗氏公司阿瓦斯汀是一种阻碍血管生成的基因重组治疗性抗体，被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗肺癌、结肠癌和直肠癌，并在欧洲获准用于治疗乳腺癌，2009年的销售额达59亿美元。

基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的研发和产业化，是其发展的关键。由于基因重组治疗性抗体上游构建技术和大量生产抗体的动物细胞大规模培养技术的落后，我国现在最高生产水平非常低，产量低导致生产成本高居不下，项目难以产业化。适宜的培养基和大规模培养工艺是目前制约重组抗体类药物表达水平的两大瓶颈。而其中找到适合生产的工作细胞的培养工艺对整个生产的作用尤为重要，是提高细胞产量的重要途径之一。差的培养工艺将导致高额的生产成本。

20世纪80年代初期，在世界卫生组织(WHO)明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，哺乳动物细胞在生物技术药物的研发中获得了长足发展。目前，用于生物制药的真核表达系统中，中华仓鼠卵巢细胞系(Chinese hamster ovary cell line，CHO)是应用最为广泛的，在美国和欧盟已批准的以哺乳动物细胞生产的生物药品中，利用CHO系统的占60％以上，且比例不断上升。常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(DHFR-)，与其他表达系统相比，CHO细胞具有如下优点：a.外源蛋白容易在CHO细胞中合成并分泌到培养基中；b.表达蛋白的折叠及二硫键的形成几乎与天然蛋白质相同；c.在正常的氨基酸位置上发生糖基化；d.能完成其他翻译后加工与修饰；e.能正确组装多亚基蛋白；f.外源基因的整合稳定；g.能以无血清培养基进行悬浮培养并达到高密度，且培养体积能达到1000L以上。因此，CHO细胞在生物制药业中受到广泛重视，而其中CHO-DHFR-细胞系(二氢叶酸还原酶缺陷型)又因为其良好的DHFR筛选系统得到了研发者的一致青睐。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。

但是，CHO细胞培养成本高，条件难掌握，在一定程度上影响了它对基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的表达水平。本发明人研究发现，不同来源，不同生长状态(贴壁，悬浮)和用于表达不同基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的CHO细胞株对营养物质的需求都不一样。因此，依据不同的细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基，已经是迫在眉睫且亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一提供了一种适于CHO细胞悬浮无血清培养的培养基，其包含下列组分：

(1)21.4g/L C6614培养基

(2)0.05～6.0mM/L谷氨酰胺

(3)0.1～100mg/L胰岛素

(4)0.1～100mM/L柠檬酸铁

调节pH为6.9-7.4。

所述适于CHO细胞悬浮无血清培养的培养基优选为

(1)21.4g/L C6614培养基

(2)4～6mM/L谷氨酰胺

(3)5.0mg/L胰岛素

(4)1.5mM/L柠檬酸铁

调节pH为7.0。

上述培养基中还可以含有脂类，其中所述脂类优选为CD lipids。

上述培养基的制备方法如下：将C6614干粉与超纯水混合搅拌后，加入谷氨酰胺、柠檬酸铁水溶液，再加入碳酸氢钠调节pH值为6.9-7.4，60分钟后再加入胰岛素，补充超纯水，10分钟后取样测定生化参数，过滤除菌。