[发明专利]一种腺病毒-甲病毒杂合病毒的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种具有造血靶向、且目的基因高效表达的腺病毒-甲病毒杂合载体的构建、病毒拯救及其在造血靶向基因修饰和药物开发中的应用。

背景技术

基因治疗已经成为遗传性疾病和部分获得性疾病的主要治疗手段，基因治疗药物也逐步成为生物药物的重要组成部分。而限制基因治疗药物发展的瓶颈是基因治疗载体缺乏靶向性以及载体整合的随机性。目前，用于基因转移的载体很多，其中腺病毒载体(Adenovector，Ad)以其宿主范围广、感染效率高、理化性质稳定、易制备高滴度病毒、不整合入宿主基因组、遗传毒性较低、能感染分裂期和非分裂期细胞等优点被广泛用于肿瘤的基因治疗。但是，常用的5型腺病毒(Ad5)载体对造血细胞感染效率很低，限制了其在造血系统或造血相关基因治疗中的应用，如白血病基因修饰瘤苗的制备、造血干细胞的基因修饰等。

(一)造血靶向腺病毒载体

Ad5主要是通过其五邻体的纤维顶球识别细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie virus and Adenovirus Receptor，CAR)进入细胞的，而造血细胞表面CAR表达水平很低；而人B组11p型腺病毒(Ad11p)可通过CD46受体分子进入细胞，且造血细胞表面CD46丰度很高。本实验室先前的研究，将5型腺病毒载体的纤维顶球部分替换为Ad11p的纤维顶球，从而改变了它的靶向性，能明显增强了对造血细胞的感染效率。以绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)为报告基因，检测了改造后的嵌合体腺病毒Ad5/F11p对CD34⁺细胞和原代白血病细胞的感染效率，在200MOI感染强度下，其对脐带或骨髓来源的CD34+细胞的感染效率为40％左右，明显高于Ad-GFP；而其对髓系白血病细胞的感染率10.58％～92.63％，中位数30％，是Ad5的10倍；但对淋巴系白血病的感染效率仍低于10％。

虽然Ad5/F11p对CD34⁺细胞和原代白血病细胞的感染率有了很大提高，但对于基因修饰来说还不是很理想，特别是淋巴系白血病细胞。但本实验室的研究表明，在淋巴系白血病细胞，CD46的表达很高，甚至比髓系白血病细胞的中还高。提示Ad5/F11p对淋巴系白血病感染效率低，可能不是病毒进入细胞困难引起的，而是报告基因表达效率低造成的。因此，简单地用报告基因表达效率表示病毒感染效率是不恰当的。

在造血细胞的基因修饰中，不但需要载体的高感染效率，也需要目的基因的高表达效率。因此，以Ad5/F11p为基础，引入目的基因高表达机制对于造血靶向基因治疗载体的研究具有重要意义。

(二)甲病毒载体

近年来的研究表明，基于甲病毒(alphavirus)的病毒载体或复制子(replicon)能在哺乳动物细胞高效介导外源基因的表达，并在疫苗制备中得到广泛应用。甲病毒为披膜病毒科成员，基因组由12kb的单股正链RNA分子组成。当病毒感染脊椎动物细胞时，进入细胞浆的基因组RNA，可将5’端约2/3序列的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)翻译并裂解加工成RNA复制和转录所需的4种非结构蛋白(non-structure protein，nsP1～4)，即复制酶。复制酶识别正链RNA 3’端，合成全长的负链RNA，作为新的基因组RNA复制和亚基因组RNA转录的模板。亚基因组mRNA是从负链RNA内部的一个位点开始转录而成的，其中的ORF翻译产生结构蛋白(衣壳蛋白，包膜糖蛋白等)，而这些结构蛋白可包装病毒基因组形成新的病毒颗粒。

基于RNA的甲病毒复制子载体，只需将甲病毒基因组的结构蛋白部分替换为目的基因即可，但此类载体需在体外转录制备成加帽的RNA，且要求在特殊条件下处理RNA并转染细胞，严重限制了其应用。而基于DNA/RNA的甲病毒复制子载体，在甲病毒基因组5’端加入一个RNA聚合酶II的启动子(如CMV等)，以DNA的形式转染进入细胞，运输到细胞核后，由RNA聚合酶II转录为RNA，再运输到细胞浆并表达非结构蛋白，从而启动亚基因组mRNA的合成，使亚基因组中的目的基因得以大量表达。

甲病毒载体的最大特点在于亚基因组能够在细胞浆大量合成，因此，目的基因表达效率高。但甲病毒对造血细胞的感染效率低，限制了它在造血细胞基因修饰中的应用，目前基本未见甲病毒载体用于造血细胞的研究报道。