[发明专利]一种利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法

权利要求书

1.构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，所述方法用于微量基因组DNA，优选的是纳克级别的基因组，更优选的是30-100ng的基因组，所述方法包括如下步骤：

步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化

目的基因组DNA和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种，其中包括各种植物、动物、微生物，例如人，植物特别是拟南芥，昆虫，特别是哺乳动物包括人、小鼠的基因组DNA；进行片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将基因组DNA打断为大小优选地为100-200bp的片段；片段化方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA；

步骤B基因组DNA的末端修饰

对于经片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA；然后优选地利用Klenow Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基；

步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理将步骤B所得到的3’末端加上“A”碱基的DNA序列在连接酶包括但不限于T4连接酶的作用下与经甲基化修饰，优选地C位点甲基化修饰的微量建库接头进行连接，优选地在序列两端都连接上微量建库接头；然后在两端加了接头的片段中加入100-500ng，优选的200ng步骤A中片段化了的拟南芥基因组DNA，然后一起用重亚硫酸盐处理，优选地处理2小时，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；

步骤D PCR扩增及文库切胶纯化

以步骤C所得到的重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列的PCR引物序列，进行PCR扩增；PCR扩增优选地使用热启动taq酶，所述热启动taq酶包括但不限于常规的r-taq或其它聚合酶，扩增产物使用优选地2％的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤C中使用的微量建库接头是表1中所示的Minim_adapter 1和Minim_adapter 2。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer 2.1。

4.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。

5.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库用于进行测序的用途，其中所述测序可通过第二代测序平台进行。

6.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的接头，其是表1中所示的Minim_adapter 1和Minim_adapter2。

7.权利要求6所述的接头用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。

8.使用权利要求6所述的接头构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。

9.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的PCR引物，其是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer 2.1。

10.权利要求9所述的PCR引物用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。

11.使用权利要求9所述的PCR引物构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。