[发明专利]一种利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及甲基化高通量测序技术领域，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序技术领域。另外，本发明还涉及标签测序技术以及实现多个样品在同一反应体系中进行构建标签文库的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。

背景技术

DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一^[1]。

当今DNA甲基化研究主要方法有：全基因组芯片杂交、全基因组甲基化敏感(非敏感)类限制性内切酶酶切等，特异位点或部分范围基因采用重亚硫酸处理结合甲基化特异PCR等^[2]。重亚硫酸盐处理(Bisulfite)结合测序是研究甲基化最常用也是最准确的方法。Illumina GA是当今应用最为普遍的新一代高通量测序仪器，现已经成功应用于全基因组甲基化测序研究^[2]，主要流程是：文库构建首先需要将基因组DNA随机打断，然后对目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“A”碱基，将3’末端带有“A”碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接(C位点甲基化修饰)，然后进行重亚硫酸盐处理，之后进行片段选择，最后通过PCR反应将目的片段进行扩增，最后回收含有DNA接头的目的片段文库^[2]，见图1。该方法的主要主要缺陷或问题是：1、不能混合多个样品进行甲基化文库构建；2、PCR扩增效率不高，需要多个循环(16个循环以上)扩增后方可得到足够量的文库进行高通量测序；3、文库构建起始需要基因组DNA 5-10μg以上，不适宜微量DNA样品建库。

发明内容

本发明在Illumina常规标签(也称为index)文库测序^[3](图2)及甲基化常规测序^[2](图1)基础上进行了三点创新的改变：1、将常规文库标签测序方法引入到甲基化测序研究中，并且修改了Illumina公司提供的常规文库标签测序接头序列(表1)，增加了6bp的碱基序列(可作为标签序列)，合成时采用甲基化修饰，增加后续PCR引物长度，对于重亚硫酸盐处理完的DNA这样有效增加了后续PCR扩增效率；2、在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源DNA进行重亚硫酸盐高效共处理，对微量的DNA片段起到保护作用，最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，使得纳克级别(30-100ng)基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实；3、改变Illumina甲基化常规测序在重亚硫酸盐处理之前要经过片段大小选择，然后再进行PCR扩增的流程，摸索出了一个不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增的条件。克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。本发明的微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库构建流程图参见图3。

表1基于Illumina GA的微量DNA全基因组甲基化高通量测序相关序列(5’-＞3’)

本发明一方面提供了全基因组甲基化高通量测序的方法，在具体的实施方式中所述方法包括如下步骤：

步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化

起始目的研究材料和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种(例如人，植物，昆虫)的基因组DNA，片段化常用的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，将基因组DNA打断为大小100-200bp的片段。上述众多常用方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA。

步骤B基因组DNA的末端修饰

片段化的DNA需要进行末端修饰，首先利用聚合酶如Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA。然后利用Klenow Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基。

步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理