[发明专利]基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法。

背景技术

鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。

ELISA方法是免疫学检验中最重要、也是最常用的方法，目前，应用抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法对病毒进行检测的研究已有许多报道。在检测DPV方法中，贾仁勇在《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究》中公开了已有基于UL24重组蛋白抗体的AC-ELISA的报道，该方法用兔抗UL24重组蛋白多克隆抗体包被酶标板，以鸭抗重组UL24蛋白多克隆抗体作为抗原捕获抗体，建立了敏感性、特异性、重复性好的DPV抗原捕获ELISA检测方法。UL51蛋白为鸭瘟病毒的一种皮层蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性，用抗重组UL51蛋白多克隆抗体建立检测DPV的AC-ELISA方法至今无报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原检测方法，该方法特异性和敏感性高的鸭瘟病毒抗原检测方法，其能捕获16ng/mL鸭瘟病毒抗原。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，具体步骤为：

a固相抗体的制备：将浓度大于或等于12.5μg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG与固相载体连结，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗体及杂质，得固相抗体；

b加待测样品：将待测样品与步骤a所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗复合物；

c与B抗重组UL51蛋白抗体IgG反应：将浓度大于或等于25μg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG与步骤b所得抗原-A抗复合物保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗-B抗复合物；

d与酶标抗体反应：将酶标抗体作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标抗体稀释液，将酶标抗体稀释液与步骤c所得抗原-A抗-B抗复合物保温反应，得抗原-A抗-B抗复合物-酶标抗体复合物；

e显色：在步骤d所得酶标抗体复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

f检测及结果判定：将步骤e所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.265时判为阳性，当OD_450nm≤0.265时判为阴性。

步骤a所述的A抗重组UL51蛋白抗体IgG中A为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物，步骤c所述的B抗重组UL51蛋白抗体IgG中B为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物，步骤d中所述酶标抗体为HRP标记的免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的动物抗B IgG。

进一步，所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的鸭瘟病毒抗原捕获ELISA法，具体步骤为：

a固相抗体的制备：将浓度等于12.5μg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG与固相载体连结，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗体及杂质，得固相抗体；

b加待测样品：将待测样品与步骤a所得固相抗体保温反应并洗涤去杂质，得抗原-A抗复合物；